上的Bands就钩选“One”,然后在后面的输入框中填上您想识别的泳道号码;
如果仅仅想识别泳道上部分光密度值最强的Bands,可以在“Bands”后面的选项中选择“Limit”,然后填上相应的数目(比如10)。Quantity One就会仅识别该泳道上光密度最大的10条Bands;
如果您发现自动识别的Bands宽度太窄,圈定Band的红色括号内范围小于黑色的光密度影。此时可以使用“Lane Width”命令来调整Bands识别的宽度。用鼠标点击“Lane Width”后面的向上箭头就会发现红色括号逐渐变宽,最后要求其范围略为宽过其包绕的Band影迹;
如果您发现自动识别功能没有识别您想要的Band或者误识别了您不想要的Band,您还可以使用上面的工具栏进行调解。将您的鼠标指向每个图标,Quantity One就会知道弹出一个黄色的提示信息告诉您这个按钮的功能。在此不再继续阐述了。
现在我们已经完成了泳道识别、背景去除、条带识别的任务。接下来我们要对Bands进行一些处理,然后就可以进行最终的结果分析了。
高斯建模:大家学过统计学知识后都知道高斯(Gauss)分布是个什么意思,在此我就不多作解释了。Quantity One认为一个理想状态的Band内部的光密度分布应该也服从高斯曲线的特征,正如前面向大家展示的3D Viewer中的图片那样。在我们日常的电泳泳道中经常出现几个相隔很近的Bands(即分子量很接近的几个蛋白或者核酸)在泳道的某个区域成串出现。此时我们很难通过会自等高线的办法精确的描绘出每条Band独立的轮廓。这个时候我们就需要对这些拥挤在一起的Bands进行高斯建模处理。Quantity One能够依据高斯曲线的特征,配合有效的背景去除,将各条紧靠在一起、边界相互融合的Bands描绘成具有独立光密度分布的相互重叠的曲线。如下图所示,原来相互融合的22、23两条Bands经过高斯建模之后变成了两个具有独立分布曲线,相互重叠的Bands。
提示:
高斯建模必须建立在有效的泳道背景去除之后。背景去除的方法可以参见我们前面的方法,即通过“Lane-Lane Backgrouds”的方式进行去除背景。去除背景的时候最好选择Rolling Disk Size小一些的方案。这样背景去除后的光密度分布曲线和高斯建模后的光密度分布曲线才能比较好的吻合。另外高斯建模并不是一个必须的步骤。它仅仅在出现多条Bands紧密排列在一起,以至于无法分辨它们之间的间隔的时候才最有效。如果Bands在泳道上松散的分布则可以不使用高斯建模。
那么如何进行高斯建模呢?很简单!只要执行“Band-Gauss Model Bands...”命令就可以,执行后Quantity One回弹出一个对话框问您要对那条泳道进行高斯建模。请钩选“One”,然后再输入需要建模的泳道代码就可以了(比如下图中的第2泳道);如果选择了“All”则对所有泳道进行高斯建模,当然建模这么多泳道会费一点时间了。
观察结果:执行完高斯建模以后使用“Band-Band Information”命令来观察结果。方法是将变成蓝色惊叹号的鼠标移到刚才已经识别的Band的部位,一个详细的“Band Information”信息框就会立刻弹出来(见下图)。在这幅图中我们必须注意的是“Trace”和/或“Gauss Model Trace”,因为我们刚才辛苦了半天就是为了得到这个数据。这个数据表示的就是Band光密度分布曲线下面积,也就是Quantity One用来表达Band内分子总量的方式。在这个信息框中还有一些重要信息比如“Mol Wt”(分子量);“Quantity/Units”等现在还是空白,咱们下以后的分析步骤中将逐渐填满它们。
提示:
Quantity One有一点让人感到很不明白。它的“Trace”和“Gauss Model Trace”都是表示曲线下面积的,可是使用的单位是OD*mm;而在另外的等高线定量方法中,同样是表示某个区域面积的单位却是OD*mm2。
下面让我们回过头来看看高斯建模之后电泳图片的分析结果到底发生了什么变化。首先是一张没有进行高斯建模的图片,大家可以看到在这张图片中的白框部分,第2泳道的第6个band的光密度曲线黄色部分并不呈高斯对称(少了一部分不是?)。这是因为它一部分和邻近的Band相互融合在一起了。
现在再来对比一下经过高斯建模后的电泳图片分析结果。还是在相同位置,这时代表第2泳道第6个Band的黄色光密度曲线是不是呈完整的高斯对称了?而且后面的“Gauss Model Trace”也不再是“N.A”,而变成了“0.717 OD”,对比上面的“Trace”=0.693 OD,大家想想为什么要大一些呢?
前面我们和大家学习了用Quantity One进行电泳条带定量的基本方法。现在我们暂时转移视线来探讨一下另一个功能,分子量预测。这个功能对于蛋白质而言是分子量预测,对于核酸而言就是核酸大小的预测了。下面我们还是以蛋白质为例来学习。
分子量预测:首先大家必须知道的是分子量的预测是建立在泳道和条带都已经创建好的基础上。我们只是人为的为一些泳道上的条带加上一个已知的标准,然后通过不同泳道和条带之间的对比绘制回归曲线,通过回归曲线的走向来预测特定条带上的分子的分子量。当然如果我们能够在一次电泳中多跑几条不同分子量成分的marker,必然能够提高我们预测的准确性。
下面我们谈谈如何操作。在已经创建好泳道和条带的图片上,执行“Match-Standard”命令,在弹出的“Select Standards”选项卡中选择一个合适的marker。如果您自己已经跑了Marker,那么请选择“New Standard”创建您自己的marker,然后在弹出的“Standard”菜单中输入您的Marker的分子量。如下图在“Standard”中输入一个名称,然后在下面的表格中输入各个Marker的分子量和名称。
输入完成以后用鼠标点击“Type”下面的小箭头(上图鼠标指向的位置),然后把变成绿色加号的鼠标移动到您的Marker泳道上相应的band。例如上图中200KD就移动到第15泳道的200KD的位置,以此类推,将每个Marker都标记上相应的数字。标记完成后,Maker泳道上的Bands就会变成蓝色。
如果您有多条Marker泳道,您可以再多表记几条以提高软件预测的准确性。现在我们执行“Match-Standard Curve”,然后用鼠标随便点击我们想要了解的泳道,Quantity One立刻就会为我们显示出一条曲线,傍边还有一个小的对话框“Std.Curve Options for Proteins”,在这个对话框中“Regression Model”选择“Point to Point Semi-log”或者“Elder-Southern”这两种回归方式;然后钩选傍边的“Show Numerical data of Points”,这时再看那条曲线上是不是已经标注了许多数字?这些数字就是水平方向上对应的Bands的分子量了。
上面说明说过,在Band Information中除了“trace”和“gauss model trace”以外我们还有几个项目没有填入数据。这些当时未填入的数据其实是“Mol.wt”和“Quantity/Unit”这2项。刚才我们已经学习了如何预测分子量,大家现在再用“Band-Band Information”命令看看您感兴趣的Band,是不是“Mol.wt”已经被填上数字了?现在只剩下“Quantity/Unit”,让我们开始学习如何测定具体的定量值(原来测定的仅仅是光密度值和Band之间的物质的量的比,而没有落实到具体的实际数字)。
创建定量标准:所谓创建“定量标准”其实类似于刚才我们设置的分子量Marker。只不过这里我们用已知Band的物质的量做为Marker,就像用5ul的DL2000跑电泳,每条Band含50ng的双链DNA。具体操作如下:执行“Analysis-Quantity Standards”,在弹出的“Calibration Curve”对话框中选择“Creat New”,在随后的“Quantity Standards”对话框中填写一系列相关信息。重要的信息包括:
1.“Units”:指作为marker的物质的量的单位,例如ng,ug,mg等等。
2.“Measure”:指对于Maker和待测Band的测量方式。点击“Measure”按钮后可以选择“Trace Density”、“Contour Density”、“Peak Density”和“Average Density”。如果您前面的分析采用的是轨迹法定量的话可以选择“Trace Density”;如果您采用的是等高线法定量可以采用“Contour Density”。
3.“Select”:在“Select”后面有三个选项,Band、Match、Lane。选中其中一个选项比如“band”,然后将变成向上小箭头的鼠标指向您自己跑的Marker条带,点击左键,就会发现此时该Band已经变成黄色。您可以多点选几个作为Marker的Bands(至少3个,多多益善),然后回到“Quantity Standards”框。这时框下部的表格变成可填写状态,在“Quantity ug”中填入相应的数字,每个数字对应您刚才标记的作marker的Bands。后面的“Dilution factor”项可暂时不管;其他两项“Lane”和“Match”主要用来一次性填入一条泳道上所有的Bands的标记,填写方法类似“Band”。
现在我们再次使用“Band-Band Information”来查看我们感兴趣的任何泳道上的条带,是不是所有的信息都填满了?包括该band的定量也直接给出了实际数字。到此我们的轨迹法定量终于告于一个段落了。
看了前面的轨迹定量法大家是不是有些头晕了?呵呵是有些烦。不过大家如果会用Quantity One提供的“Automation manager”就可以把前面的繁琐程序一步搞定了。不过我也不打算在这里教大家用这个工具