(3)编码88个核苷酸的tRNA的基因有多长?

(4)编码细胞色素C(104个氨基酸)的基因有多长?(不考虑起始和终止序列)

(5)编码相对分子质量为9.6万的蛋白质的mRNA，相对分子质量为多少?(设每个氨基酸的平均相对分子质量为120) (6)λ噬菌体DNA长17μm，一突变体DNA长15μm，问该突变体缺失了多少碱基对?

2. 对一双链DNA而言，若一条链中(A+G)/(T+C)=0.7，则：(1)互补链中(A+G)/(T+C)=?(2)在整个DNA分子中(A+G)/(T+C)=?(3)若一条链中(A+T)=(G十C)=0.7，则互补链中(A+T)/(G+C)=?(4)在整个DNA分子中(A+T)/(G+C)=? 3. 试述下列因素如何影响DNA的复性过程。 (1)阳离子的存在，(2)低于Tm的温度， (3)高浓度的DNA链。 4. 如何让一个超螺旋的环状病毒DNA分子采取其松弛态? 线形双链DNA能否形成超螺旋? 5．用稀酸或高盐溶液处理染色质，可以使组蛋白与DNA解离，请解释。 6. 在酶切反应缓冲液中加入BSA的目的是什么?机理是什么?

7. 有些噬菌体和质粒常常编码一些抗限制性酶的蛋白以中和宿主的限制系统。你认为噬菌体和质粒还有哪些可能的方式避免宿主的限制作用?

8. 下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是Ⅱ类酶的识别序列： GAATCG， AAATIT， GATATC， ACCCCA ? 为什么?

9. 当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施?为什么? 10. 什么是限制性内切核酸酶的星号活性?受哪些因素影响? 11. 用于克隆的DNA在质量上有什么要求? 12. 为什么从细胞中分离DNA时往往会断裂? 13. 为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离?

14. 为什么氧化变色的酚不能直接用于DNA的分离?应如何处置?

15. 在DNA分离过程中，酚通常与氯仿联合使用，即使不联合使用也要在苯酚抽提后用氯仿再抽提一次，为什么? 16. 何谓简并引物(degenerate Primer)?

17. 双脱氧法(dideoxynucleotide method)测序的基本原理是什么? 18. 限制性内切核酸酶有哪些特点?

19. 一个线形的DNA分子分别被两种限制性内切酶或同时被两种内切酶消化，消化的结果是： 限制性内切酶 片段大小（Kb） BamHⅠ 8.0, 7.5, 4.5, 2.9 Bgl Ⅱ 13, 6, 3.9 BamH I/Bgl Ⅱ 7.5, 6, 3.5, 2.9, 2, 1

根据以上结果，画出该DNA的物理图谱。

20. 什么是Western印迹？它与Southern 印迹有什么不同？ 21. 简并引物设计的一般原则是什么？

22. 大肠杆菌在其细胞内产生核酸(DNA)限制性内切酶的意义是什么?它本身的核酸限制性内切酶对其细胞内的DNA是否

作用?

23．用lmol/L的KOH溶液水解核酸，两类核酸(DNA及RNA)的水解产物是否相同? 24．分离DNA时，为什么要在缓冲液中加入一定浓度的EDTA和蔗糖?

25．PCR的基本原理是什么?用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息?

六、参考答案 （一）名词解释

1．由单核苷酸通过磷酸二酯键相连而组成的高分子化合物，称为核酸。它可以分为DNA和RNA两类。 2．核苷酸残基在核酸分子中的排列顺序就称为核酸的一级结构。 3．两条DNA单链通过碱基互补配对的原则，所形成的双螺旋。

4. 在形成双螺旋结构的过程中,由于各种碱基的大小与结构的不同，使得碱基之间的互补配对只能在G?C(或C?G)和A?

T(或T?A)之间进行，这种碱基配对的规律就称为碱基配对规律(互补规律)。

5．核酸分子中除了常见的五种碱基外，还可能含有其它微量的碱基，这些碱基称为稀有碱基。由稀有碱基形成的核苷酸以

及碱基与戊糖之间以非正常N—C糖苷键所形成的核苷酸都称为稀有核苷酸。

6．单核苷酸分子中的磷酸基分别与戊糖的3'-OH及5'-OH形成酯键，这种磷酸内酯的结构称为环化核苷酸或环核苷酸。 7．5'-核苷酸的磷酸基进一步磷酸化成二磷酸核苷、三磷酸核苷或更多的磷酸核苷，它们都被称为多磷酸核苷酸。 8．当核酸分子加热变性时，其在260nm处的紫外吸收会急剧增加的现象称为增色效应。

9．当加热变性了的核酸分子，在退火的条件下发生复性时，其在260nm处的紫外吸收会减少的现象称为减色效应。

10．单链RNA分子也会在分子内部形成部分双螺旋的结构，由于这种部分双螺旋的结构有些象发卡，所以把这种部分双螺

29

旋的结构称为发卡结构。

11．当两条不同来源的DNA(或RNA)链或DNA链与RNA链之间存在互补顺序时，在一定条件下可以发生互补配对形成双

螺旋分子，这种分子称为杂交分子。形成杂交分子的过程称为分子杂交。

12．当核酸分子加热变性时，其在260nm处的紫外吸收会急剧增加，当紫外吸收变化达到最大变化的半数值时，所对应的

温度称为熔解温度、变性温度或用Tm值表示。

13.回文序列(palindromic sequence)是一段自我互补的序列，即同其互补链一样的序列 (两者的阅读方向都是从5′→3′)。根据回文序列的结构可分为：完全的回文序列、不完全的回文序列和间断的回文序列。完全的回文序列(GAATTC)，通常是限制性内切核酸酶的识别序列，不完全的回文序列(如TACCTCGGCGTGATA)，常是其他蛋白质的结合位点(如阻遏蛋白)，在基因表达调控中有重要作用。间断的回文序列(如GGTTXXXAACC，有一段是颠倒的重复)，它可使单链的核苷酸有可能在tRNA中见到的一样，形成发夹环的结构，间断的回文序列又称反向重复序列。

14．不同来源的限制性内切核酸酶具有相同的识别序列，产生完全相同的黏性末端，将这些酶称为同裂酶(isoschizomer)。 15.限制性物理图谱即限制性内切核酸酶作图(restrictionmapping)。简单地说就是DNA分子中限制性内切核酸酶切割位点的定位，即DNA分子中各种不同限制性内切核酸酶的酶切位点的线性排列图。即标明限制酶在DNA分子上的限制性位点的数目、限制性片段大小及其线性排列的顺序。

（二）填空题

l. RNA DNA RNA 胞液 DNA 细胞核

2. 磷酸 戊糖 碱基 β-D-核糖 β-D-2-脱氧核糖 嘌呤 嘧啶 3. A G C U T 稀有碱基

4．戊糖 嘧啶β-D-2-脱氧核糖 T β—D-核糖 U

5. AMP GMP CMP UMP dAMP dGMP dCMPdTMP 3′，5′—磷酸二酯 6；双螺旋 A＝T G＝C A+G＝C+T 7．0.53 0.25

8．9 1 1，9—糖苷键 嘌呤核苷 9．1 1 1，1—糖苷键 嘧啶核苷 10．CAMP cGMP 作为激素的第二信使 11，三磷酸腺苷 脱氧二磷酸胞苷 12．碱基 长度 低 高 高

13．C H 0 N P 磷 9％～10％ 磷 14．氢键 碱基平面间疏水堆积力(范德华力) 15．大 高

16．mRNA tRNA rRNA 合成蛋白质的模板 运输氨基酸的工具 与蛋白质结合成核糖体是合成蛋白质的场所 17.多核苷酸链 双螺旋 三叶草 18.rRNA mRNA tRNA 19．结合氨基酸 辨认密码子 20．CCA 反密码子

21．7—甲基鸟苷酸 多聚腺苷酸

22．2～4个相同的；切割位点；识别位点的；平切和交错切；平 黏性末端；Mg2+；ATP SAM 23. (1)能够在中间划一个对称轴，两侧的序列两两对称互补配对；

o

(2)两条互补链的5′→3′的序列组成相同，即将一条链旋转180，则两条链重叠 24．(1)溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂；

(2)溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来； (3)对RNase、DNase有一定的抑制作用；

(4)SDS能够与蛋白质结合形成复合物，使蛋白质变性沉淀

25．(1)使蛋白质变性； (2)使核小体和核糖体解聚，提高DNA的得率 26．可以降低表面张力，从而减少气泡产生

27．(1)水解能力很强，作用范围广；(2)在SDS和EDTA中仍保持高活性，可以同SDS 和EDTA同时使用 28．螯合Mg2+离子，抑制核酸酶的活性

29．中和DNA分子的负电荷，增加DNA分子间的凝聚力

30．(1)包埋吸水法；(2)蒸发； (3)膜过滤法；(4)有机溶剂抽提法 31．-70℃

32．只将RNA分离出来；可将DNA与RNA一起分离出来 33．(1)核酸酶降解；(2)化学降解；(3)物理剪切 34．酸变性；碱变性；热变性； 酶水解

30

35．抑制真菌污染的

36．dI可以同任何碱基相匹配

37．手上常有核酸酶 38. 一组混合

39．DNA溶解；作为螯合剂，抑制核酸酶的活性 40．抑制RNase； 金属离子的螯合

（三）选择题

1. D 2. B 3. B 4.B 5.B 6. A 7. C 8. D 9. C 10.D 11.A 12.A 13.D 14.C 15.D 16.D 17.C 18．D 19.C 20.A 21.A 22.D 23.A 24.B 25. B 26. B 27．B 28．B 29．C 30．D 31．C 32. B 33．A 34．C 35. B

（四）是非题

1．错 2．错 3．对 4．错 5．对 6. 错 7．错 8．对 9．错 10．错 11．错 12．错 13．对 14．对 15．错 16．对 17．错 18．错 19. 对 20．错 21．对 22．对 23．对 24．对 25．错 26．对 27．对 28． 错 29．对 30．对 31．错 32．对 33．错 34．错 35．错 36. 错 37. 对 38. 错 39.对 40. 错 41．错 42．对 43．错 44. 错 45．错 46．对 47．对 48．对 49．对 50．错

（五）问答题

1. (1) (2.5×107/650)×0.34=1.3×104nm=13μm (2)650/0.34=1.9×103/nm=1.9×106/μm

(3)88×0.34nm=30nm=0.03μm (4)104×3×0.34=106nm≈0.11μm

(5)(96000/120)×3×320=76800 (6)(17—15)X103/0.34=5.88×103bp

2．(1)设DNA的两条链分别为α和β，那么Aα=Tβ，Tα=Aβ，

Gα=Cβ，Cα=Gβ，

因为，(Aα+Gα)/(Tα+Cα)=(Tβ+Cβ)/(Aβ+Gβ)=0.7 所以，互补链中(Aβ+Gβ)/(Tβ+Cβ)=I/0.7=1.43

(2)在整个分子中 因为，A=T，G=C， 所以，A+G=T+C，(A+G)/(T+C)=1 (3)假设同1，则 Aα+Tα=Tβ+Aβ,Gα十Cα=Cβ+Gβ， 所以 (Aα+Tα)/(Gα+Cα)=(Aβ+Tβ)/(GβCβ)=0.7

(4)(Aα+Tα+Aβ+Tβ)/(Gα+Cα+Gβ+Cβ)=2(Aα+Tα)/2(Gα+Cα)=0.7

3. (1)阳离子可以中和DNA中带负电荷的磷酸基团，减弱DNA链间的静电作用，促进两条互补的多核苷酸链的相互靠近，从而促进DNA的复性。

(2)温度升高可使DNA变性，因此温度降低到熔点以下可以促进DNA的复性。 (3)DNA链的浓度增加可以加快互补链随机碰撞的速度，从而促进DNA的复性。

4. 核酸内切酶作用于超螺旋的环状病毒DNA分子，在其中的一条链上产生“缺刻”(nick)，释放张力，则超螺旋转变为松弛态。线形DNA分子只有当两端都被固定时，才能产生超螺旋。

5. 组蛋白与DNA之间的结合依靠的是组蛋白带正电的碱性基团与DNA带负电荷的磷酸基团之间的静电引力，如果用稀酸处理复合物，则磷酸基团质子化而失去所带的负电荷，复合物解离。如果用高盐溶液处理复合物，则阳离子与磷酸基团结合而取代了组蛋白，导致组蛋白与DNA解离。

6. 目的是保护酶活性，机理是通过提高溶液中蛋白质的浓度，防止酶失活。

7. 某些噬菌体的基因组中有修饰的碱基，因此对限制性内切核酸酶具有免疫作用。另一种避免限制酶切割的途径是抑制SAMase的活性，该酶制造S—腺苷甲硫氨酸，某些限制酶作用时需要S—腺苷甲硫氨酸。然而，噬菌体在发育过程中不能同某些单碳的供体反应。

8. GATATC；AAATTT，因为它们是回文序列。

9. 注意星号活性，先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星号活性。或使用通用缓冲液。

10. Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的

31

特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星号活性。概括起来，诱发星号活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量(>5％，v／v)；(2)限制性内切核酸酶用量过高（100U/μg DNA）；(3)低离子强度(<25：mmol／L)；(4)高pH(8.0以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+，Cu2+，CO2+，Zn2+等)。

11. (1)首先是稳定性：保持DNA的高分子量和原有的构型。

(2)低蛋白质含量。 (3)DNA样品中应不含RNA (4)不含可透析的小分子

12. (1)细胞内存在很高的核酸酶活性,DNA裸露后，很容易遭到核酸酶的降解； (2)在分离DNA的过程中，要用到一些酸碱等化学试剂，也会使DNA断裂；

(3)在DNA的分离过程中要经过多次离心、吸取、转移等，产生的机械张力剪切会使DNA断裂。

13. 由于苯酚呈酸性，并且常常会氧化产生自由基，直接用于DNA的分离，会使DNA遭到破坏，所以，用前需要重蒸除去氧化物，然后用Tris-HCl饱和酚，并调整pH到中性。用缓冲液饱和酚还有第二个作用，就是防止酚吸收更多的DNA溶液，降低DNA的损失率。

14. 因为苯酚与空气接触氧化成粉红色的醌。苯酚氧化生成的醌能够形成游离的自由基，这种自由基能够引起磷酸二酯键的断裂，造成DNA降解。氧化的苯酚须经高温重蒸以除去氧化物，并且在重蒸后的酚中添加抗氧化剂，β—巯基乙醇和8—羟基喹啉，浓度只需0．1％。重蒸酚能够用锡箔纸包起来避光保存在低温下。

15. 原因是酚和水有一定程度的互溶，所以单独使用酚抽提DNA，最终不能除去酚，残留的酚会使起切割和连接作用的限制性内切核酸酶和连接酶变性。氯仿也是蛋白变性剂，它不与水互溶，但是能够同苯酚互溶，这样，酚和氯仿联合使用，就可以带走残留的酚。

16. 所谓简并引物是指根据肽链的氨基酸序列(或部分序列)，并充分考虑密码子的简并性而设计的、用于PCR扩增的混合引物群体，这种混合引物之间具有不同的碱基组成，但碱基的数量是相同的。由于充分考虑了密码的简并性，在这种混合引物中必定有一种引物是可以和该基因的DNA序列精确互补。

17. 双脱氧的核苷酸是人造的分子，这种分子糖环的2’和3’碳上都没有了羟基基团，而在天然分子中糖环的3’碳上有一个羟基。在DNA复制中，新掺人的碱基按配对原则是天然三磷酸核苷酸，用它的5'-P同生长链的前一个核苷酸的3’羟基连接。但是，若进入的核苷酸是双脱氧的，则由于3’没有羟基而影响下一个磷酸二酯键的形成，使DNA的复制终止。 18. 限制性内切核酸酶分为三类，重组DNA技术的限制性内切核酸酶为Ⅱ类。其特点为：①识别DNA位点的核苷酸序列呈二元旋转对称即回文结构(palindrome)。②一些酶切割后产生粘性末端(sticky end ), 另一些酶切割后产生平端或钝性末端(blunt end)。③不同的限制性内切核酸酶识别DNA中的核苷酸长短不一，为4、6或8个。

19. 在双酶切时，有三个片段(7.5，2.9和6Kb)没有被切成更小的片段，这说明它们内部没有其他酶的切点(如7.5Kb BamH I片段内无Bgl Ⅱ切点)。用Bgl Ⅱ消化产生3个片段说明整个DNA分子上具有2个Bgl Ⅱ切点，同样可以推断DNA上还有3个BamH I切点。13和3.9Kb Bgl Ⅱ酶切片段在双酶切后消失了，这说明这两个片段内部具有BamH I切点。而2.9Kb与lKb之和为3.9Kb，这提示3.9Kb的Bgl Ⅱ酶切片段内有一个BamH I切点。2Kb，7.5Kb与3.5Kb之和为13Kb则说明13Kb的Bgl Ⅱ酶切片段内含有2个BamH I切点。此外，3.5Kb与lKb之和为4.5Kb则说明4.5Kb的BamH Ⅰ酶切片段

内含有一个Bgl Ⅱ切点。综合以上结果，原来的线形DNA的物理图谱为：

20. Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与Southern的不同在于探针的性质不同，在Western印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。 21. (1)选择保守区设计简并引物；

(2)选择简并性低的氨基酸密码区设计引物； (3)注意密码的偏爱性；

32