一一 一 一

干扰质粒质粒的构建 人工合成针对人

中部碱基处的反向互补序列端加

端加入粘性木端序列如下合成后上下游寡 入粘性术端

核苷酸链在 溶液中于沸水浴中后自然冷却即得到双链的带 粘性末端的 有矛 片段质粒用

酶切回收然后进行连接转化 感受态菌卡那抗生素筛选阳性 克隆

片段是否接入用测序鉴定鉴定正确后在体外验证其干 扰效果 门一 一

一表达载体的构建在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究 网站检索得到序列根据丌放读码框设计引物序列如下 上游引物引入 酶切位点下游引物引入酶切位点以抽提的大鼠 肾脏组织为模板扩增胶回收后用 酶切

质粒同样进行双酶切后回收片段载体进行连接然后进行连接转化 感受态菌氨苄抗生素筛选阳性克隆酶切鉴定 细胞转染

脂质体法公司在培养皿中接种适量

细胞使之培养后汇合率达到在不同离心管中分别加入 无血清分别加入肛质粒和脂质体分别混匀后室 温放置

将溶液和脂质体溶液混合轻柔混匀室温放置 转染前细胞用预温的无血清洗涤一遍加入 无血 清随后将质粒一脂质体复合物滴加至细胞表面置 孵箱内培养 后吸去一脂质体复合物加入含的 培养基继续培养 裂解细胞提取总蛋白 法公司在孔培养皿中接种适量使之培

养后汇合率达到在不同离心管中分别加入生理盐水 并混匀随即将溶液加入溶液振 分别加入质粒和

荡混匀室温放置

将质粒脂质体复合物滴加至细胞表面置 孵箱内培养裂解

稳定转染细胞转染后胰酶消化按传代细胞贴壁后加入 培养以维持其性状 两周左右挑取单克隆细胞 抽提

待六孔板中细胞生长至汇合度 室温孵育 加入

加入氯仿剧烈振荡室温孵育 ℃离心

吸取上层含有的水相入新管加入异丙醇沉淀室温孵育

离心第二军医大学博士学位论文 弃上清加入

的乙醇洗涤矾沉淀℃离一 水溶解 干燥用

用紫外分光光度计测定的含量保存准备做 ∽四∽●

操作步骤 合成第一链 总

随机引物 立星丞 鱼丛 ℃ 冰浴至少 × 肛 ℃ ℃ ℃

在人胶质瘤中对水通道蛋白调控作用的研究 反应 取上述合成的