复习题 名词解释：
1. 不可逆性抑制：抑制剂与酶的必需基团共价结合，引起酶活性丧失，抑制剂不能用超滤、透析、凝胶过滤等方法除去。 2. 底物抑制：当一分子底物与酶的一个位点结合，另一底物与酶的另一位点结合,往往出现死端复合物，对酶产生抑制作用。过量的底物可视为反竞争性抑制作用。 3. 别构抑制剂：抑制剂与酶活性中心外的部位结合，通过改变酶的空间构象，从而影响酶与底物的结合，或影响酶的催化效率。这种抑制剂称为别位抑制剂（allosteric inhibitors），别构抑制剂，或变构抑制剂。 4. 酶的自杀性底物：Kcat型不可逆抑制剂又称酶的自杀性底物，也是底物的类似物，酶的自杀性抑制剂可以作为酶的底物与酶活性中心相结合，生成酶-底物复合物，并接受酶的催化作用。然而，经催化后的中间产物不游离出产物，而是转化为酶的抑制剂，进一步与酶活性中心共价结合，对酶产生抑制作用。自杀底物都有其自身的作用对象，专一性很高。 5. 酶的激活剂：激活剂是指能提高酶促反应速率的物质，此物质不是酶和酶的底物。其中通过与酶分子结合来提高酶促反应速率的激活剂称为酶的激活剂
6. 酶偶联的定法：酶耦联测定法是利用酶作为分析试剂，对一些酶的活性和一些化合物（底物浓度、激活剂、抑制剂、酶的辅助因子、嘌呤、核苷酸等）进行定量分析的一种方法。
7. 酶的提取典型的抽提液由哪些组分组成？
典型的抽提液由以下七方面组分组成（可根据需要予以取舍）： 抽提液包括：
离子强度调节剂：KCl、NaCl、蔗糖(细胞内的离子强度=0.3mol/L) pH缓冲液：各种缓冲液
温度效应剂：甘油、二甲亚砜
蛋白酶抑制剂： 苯甲磺酰氯（PMSF)、二异丙基氟磷酸（异氟磷,DIFP) 抗氧化剂：二硫苏糖醇（DTT）、?-巯基乙醇 重金属络合剂：EDTA、柠檬酸 增溶剂：TritonX-100、脱氧胆酸盐 8. 酶的提取及纯化的注意事项 ㈠酶的提取的注意事项：
①盐的浓度要使酶稳定，而其他蛋白质不稳定； ②pH要远离pI，但不能影响酶的稳定性；
③有机溶媒含量使酶稳定，其他蛋白质不稳定； ④提取液的温度应控制在４°Ｃ以下，防止酶变性。
此外，溶液中增加底物可以提高酶的溶解度，加入稳定剂，如二硫苏糖醇或?-巯基乙醇等防止巯基氧化；
加入蛋白酶抑制剂可以防止所提取的酶被水解。 ㈡酶纯化的注意事项：
①建立一个可靠和快速的酶活性测定方法
在纯化过程中需要大量时间检测不同纯化阶段的酶活性。所以要求检测方法快速、简捷、灵敏、专一和准确。快速比准确更重要。如用5分钟可以检测出酶活性方法的准确性的误差为5%，比用30分钟检测的误差为0.5%好。因为前者可以缩短纯化时间，大大地减少酶失活的可能性。
一个好的检测活性方法的建立,就是整个纯化工作成功的一半。 ②酶环境：酶不仅是催化剂，而且也是活细胞中代谢机制的组成成分，试管中的环境与细胞内的环境是大不相同的，不能忽视这一差别可能对酶行为的影响。纯化过程可在很多方面影响酶的活性。如辅因子的去除、细胞结构成分（如脂膜）的去除等。如?-羟丁酸脱氢酶反应需要加入脂类。
③控制温度和时间：整个纯化过程均应在0°C的条件下进行，且时间不宜过长，最好在2-3天内完成；
④在纯化酶的过程中常加入一些酶的保护剂，如二硫苏糖醇或?-巯基乙醇等保护巯基酶；
⑤避免酸、碱。酶溶液的pH不要低于5和高于9。加酸碱时要防止局部浓度升高；
⑥防止表面变性。转移、搅拌、加固体盐时应防止气泡。
⑦有机溶剂应预冷后加入，防止酶的变性和产生溶解热。同时防止局部浓度过高；
⑧去垢剂有时虽可有助于酶的溶解，但有时难免发生酶变性；
⑨酶的保存：冻融不失活的酶可以在低温冰箱中保存数月；在高盐浓度稳定的酶可以悬浮于饱和硫酸铵中；真空冷冻干燥的酶粉易溶解，并可在室温下保存；酶在提取和纯化的过程中不怕霉菌污染，但在保存过程中应予以预防。 9. 列举至少五种酶的纯化方法。
①改变介电常数：在溶液中加入与水互溶的有机溶剂（如 乙醇、丙酮等）可显著地降低溶液的介电常数，从而使酶分 子相互之间的静电作用加强而发生沉淀。 ②超滤(ultrafiltration)：在一定的压力下，使蛋白质溶液在通过一定孔径的超滤膜时，小分子量物质滤过，而大分子量的蛋白质被截留，从而达到分离纯化的目的。这种方法既可以纯化蛋白质，又可达到浓缩蛋白质溶液的目的。
③离子交换柱层析：根据不同的被分离物质与分离介质间异种电荷的静电引力不同来进行分离的方法。
④亲和层析：利用酶分子独有的专一性结合位点或结 构性质的分离方法。
⑤免疫吸附层析：抗原-抗体的高专一性应用于酶的纯化 过程。利用酶的单克隆抗体来亲和特异性的酶。 10. 酶的纯度指标鉴定。
11. 什么是对照实验？简述其类型及方法。
对照试验：为消除所测定的产物中不是由该酶催化所生成的部分。 类型：样品对照，底物对照，时间对照
样品对照方法：对照管的反应液中不加底物。 底物对照方法：对照管中不加待测的样品。 时间对照方法：反应混合物中含有样品和底物，但反应时间为 0 时的测定值为对照值。可以在加入底物前加入蛋白变性剂或反应抑制剂，也可在加入样品前加入蛋白变性剂。
12. 酶纯化过程中实验记录的项目。
13. 酶纯化过程中的注意事项。 酶纯化的注意事项：
①建立一个可靠和快速的酶活性测定方法
在纯化过程中需要大量时间检测不同纯化阶段的酶活性。所以要求检测方法快速、简捷、灵敏、专一和准确。快速比准确更重要。如用5分钟可以检测出酶活性方法的准确性的误差为5%，比用30分钟检测的误差为0.5%好。因为前者可以缩短纯化时间，大大地减少酶失活的可能性。
一个好的检测活性方法的建立,就是整个纯化工作成功的一半。 ②酶环境：酶不仅是催化剂，而且也是活细胞中代谢机制的组成成分，试管中的环境与细胞内的环境是大不相同的，不能忽视这一差别可能对酶行为的影响。纯化过程可在很多方面影响酶的活性。如辅因子的去除、细胞结构成分（如脂膜）的去除等。如?-羟丁酸脱氢酶反应需要加入脂类。
③控制温度和时间：整个纯化过程均应在0°C的条件下进行，且时间不宜过长，最好在2-3天内完成；
④在纯化酶的过程中常加入一些酶的保护剂，如二硫苏糖醇或?-巯基乙醇等保护巯基酶；
⑤避免酸、碱。酶溶液的pH不要低于5和高于9。加酸碱时要防止局部浓度升高；
⑥防止表面变性。转移、搅拌、加固体盐时应防止气泡。
⑦有机溶剂应预冷后加入，防止酶的变性和产生溶解热。同时防止局部浓度过高；
⑧去垢剂有时虽可有助于酶的溶解，但有时难免发生酶变性；
⑨酶的保存：冻融不失活的酶可以在低温冰箱中保存数月；在高盐浓度稳定的酶可以悬浮于饱和硫酸铵中；真空冷冻干燥的酶粉易溶解，并可在室温下保存；酶在提取和纯化的过程中不怕霉菌污染，但在保存过程中应予以预防。 14. 酶的分子量测定方法。 ①分析超离心法 ②凝胶过滤法
③SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳 15. 酶活力测定方法类型及特点。
①定时法:测定反应开始后某一段时间（t1?t2）内，产物（或底物）的变化量来求取反应的初速率。此法又称两点法。但t1常采用反应开始的时间，即t1= 0。此法需要在t2时终止反应。
②连续监测法:又称动力学法或速率法。该法连续测定（每15秒?1分钟间隔
监测一次）酶促反应过程中底物或产物浓度随时间的变化，从其直线部分求出反应的初速率。
③平衡法:又称终点法，测定反应达到平衡时底物或产物的总变化量，再计算酶的活力。此法无需以时间来计算反应速率，只是待测标本与正常标本在相同条件下反应，以比较待测标本是否正常。 16. 写出米-曼式方程式并简述Km的意义。
㈠米-曼式方程式:
㈡Km的意义:
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①Km是酶的特性常数。当pH、温度、离子强度不变的条件下，酶的Km值m不因反应中酶的浓度变化而改变。即Km只与酶的性质有关，而与酶的浓度
1无关。
②Km值是反应速率为最大速率一半时的底物浓度。Km已知时，可求得任一底物浓度时酶活性中心被底物饱和的分数。
③当k3很小时，Km = k2/k1，Km ? Ks 代表酶对底物的亲和力。Km大则亲和力小。
④已知Km和细胞内底物的浓度，则可知该酶在细胞内是否受此底物调节。 ⑤对于可逆反应，可根据对正逆两向底物Km值的不同，推测正逆反应的效率，以了解酶的主要催化方向和生理意义。对于代谢过程中的连续反应由不同的酶催化时， Km值和相应的底物浓度可以帮助了解代谢的限速步骤。 ⑥一种酶催化多种底物时，从Km值可以了解天然底物，成为酶命名的依据。 17. 何为酶促反应初速率？反应时间、酶的浓度、底物浓度及反应的平衡常数与初速率有何关系？
㈠酶促反应初速率:一级反应期所测得的反应速率不能代表酶的活力，只有0级反应所测得的反应速率才能真正代表酶 活力，此时的反应速率称为初速率。即反应刚刚开始时,没有任何影响因素对反应速率施加影响时的反应速率。 ㈡
18. 简述双分子反应的类型及机制特点。
类型:①单单反应 ②双单反应③双双反应④三双反应⑤三三反应 机制特点:
Vmax·[S]k+kv= ──────K=[S] + kKmA + BEP + Q