生 物 化 学 实 验 讲义
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20滴 20滴 20滴
10滴 10滴 10滴
－ － －
10滴 － －
－ 10滴 －
－ － 10滴
5滴 5滴 5滴
2. 将上述各管放入37℃水浴中保温10分钟，然后每管加入碘液1滴，混匀后观各管颜色的区别，并说明激动剂和抑制剂对酶促反应的影响。
注意事项
1.反应试管应清洗干净，不同酶液、试剂及其滴管不能交叉混用； 2.使用混合唾液，或通过预试选出合适的唾液稀释度，效果更为显著。
思考题
1.简述温度、pH、激动剂及抑制剂、酶浓度等因素影响对淀粉酶活性的影响。 2.简述淀粉酶活性测定的原理及注意事项。
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实验十六 维生素C的定量测定（2,6-二氯酚靛酚滴定法）
一、目的要求
（1）学习并掌握定量测定维生素C的原理和方法。 （2）了解蔬菜、水果中维生素C含量情况。
二、实验原理
维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，缺少它时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸（ascorbic acid）。它对物质代谢的调节具有重要的作用。近年来，发现它还有增强机体对肿瘤的抵抗力，并具有化学致癌物的阻断作用。
维生素C是具有L系糖型的不饱和多羟基物，属于水溶性维生素。它分布很广，植物的绿色部分及许多水果（如橘子、苹果、草莓、山楂等）、蔬菜（黄瓜、洋白菜、西红柿等）中的含量更为丰富。
维生素C具有很强的还原性。它可分为还原性和脱氢型。金属铜和酶（抗坏血酸氧化酶）可以催化维生素C氧化为脱氢型。根据它具有还原性质可测定其金属含量。
还原型抗坏血酸能还原染料2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），本身则氧化为脱氢型。在酸性溶液中，2,6-二氯酚靛酚呈红色，还原后变为无色。因此，当用此染料滴定含有维生素C的酸性溶液时，维生素C尚未全部被氧化前，则滴下的染料立即被还原成无色。一旦溶液中的维生素C已全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成粉红色。所以，当溶液从无色变成微红色时即表示溶液中的维生素C刚刚全部被氧化，此时即为滴定终点。如无其它杂质干扰，样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含还原型抗坏血酸量成正比。
本法用于测定还原型抗坏血酸，总抗坏血酸的量常用2,4-二硝基苯肼法和荧光分光光度法测定。
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OCHOHOHHOCOCCl+ONOHH+CCCH OH2ClOHCl色)2，6－二氯酚靛酚(红还原型抗坏血酸OCOOHHOCOCCOClNO(蓝色)Cl+OClNHOHCCH OH2还原型2，6－二氯酚靛酚(无色）氧化型脱氢抗坏血酸
三、实验器材.
锥形瓶（100ml），组织捣碎器，吸量管（10ml），漏斗，滤纸，微量滴定管（5ml），容量瓶（100ml，250ml）。 四、实验试剂
1、苹果、卷心菜等。
2、2%草酸溶液: 草酸2g溶于100ml蒸馏水中。 3、1%草酸溶液: 草酸1g溶于100ml蒸馏水中。
4、标准抗坏血酸溶液（1mg/ml）: 准确称取100mg纯抗坏血酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用）溶于1%草酸溶液中，并稀释至100ml，贮于棕色瓶中，冷藏。最好临用前配制。 5、0.1% 2,6-二氯酚靛酚溶液: 250mg 2,6-二氯酚靛酚溶于150ml含有52mg NaHCO3的热水中，冷却后加水稀释至250ml，贮于棕色瓶中冷藏（4℃）约可保存一周。每次临用时，以标准抗坏血酸溶液标定。
五、操作步骤 1、提取
水洗干净整株新鲜蔬菜或整个新鲜水果，用纱布或吸水纸吸干表面水分。然后称取20g，
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加入20ml 2%草酸，用研钵研磨，四层纱布过滤，滤液备用。纱布可用少量2%草酸洗几次，合并滤液，滤液总体积定容至50ml。 2、 标准液滴定
准确吸取标准抗坏血酸溶液1ml置100ml锥形瓶中，加9ml 1%草酸，用微量滴定管以0.1% 2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至淡红色，并保持15s不褪色，即达终点。由所用染料的体积计算出1ml染料相当于多少毫克抗坏血酸（取10ml 1%草酸作空白对照，按以上方法滴定）。 3、样品滴定
准确吸取滤液两份，每份10ml, 分别放入2个锥形瓶内，滴定方法同前。另取10ml 1%草酸作空白对照滴定。 4、计算
维生素C含量（mg/100g样品）＝(VA-VB)?C?T?100D?W
式中：VA为滴定样品所耗用的染料的平均毫升数； VB为滴定空白对照所耗用的染料的平均毫升数； C为样品提取液的总毫升数；
D为滴定时所取的样品提取液毫升数；
T为1ml染料能氧化抗坏血酸毫克数（由操作二计算出）； W为待测样品的重量（g）。
六、结果讨论
(1) 某些水果、蔬菜（如橘子、西红柿等）浆状物泡沫太多，可加数滴丁醇或辛醇。 (2) 整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。滴定过程一般不超过2min。滴定所用的染料不应小于1ml或多于4ml，如果样品含维生素C太高或太低时，可酌情增减样液用量或改变提取液稀释度。
(3) 本实验必须在酸性条件下进行。在此条件下，干扰物反应进行得很慢。 (4) 2%草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用，而1%草酸无此作用。 (5) 干扰滴定因素有：
若提取液中色素很多时，滴定不易看出颜色变化，可用白陶土脱色，或加1ml氯仿，到达终点时，氯仿层呈现淡红色。
Fe2＋可还原二氯酚靛酚。对含有大量Fe2＋的样品可用8%乙酸溶液代替草酸溶液提取，此
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时Fe2＋不会很快与染料起作用。
样品中可能有其它杂质还原二氯酚靛酚，但反应速度均较抗坏血酸慢，因而滴定开始时，染料要迅速加入，而后尽可能一点一点地加入，并要不断地摇动三角瓶直至呈粉红色，于15s内不消退为终点。
(6) 提取的浆状物如不易过滤，亦可离心，留取上清液进行滴定。 思考题：
1．为了测得准确的维生素C含量，实验过程中都应注意哪些操作步骤？为什么？ 2．试简述维生素C的生理意义。
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