生物化学实验

生 物 化 学 实 验 讲义

二、材料

干酵母粉。 三、器材

乳钵;容量瓶(10ml),移液管(2.0ml, 5.0ml),量筒(10, 50ml),沸水浴,离心机,布氏漏斗,抽滤瓶,石蕊试纸,滴管等。

五、操作方法

一、酵母RNA提取

称5g干酵母粉置于100ml烧杯中,加入40ml0.2%NaOH溶液,沸水浴上加热30min,经常搅拌。然后加入数滴乙酸溶液使提取液呈酸性(石蕊试纸检查),3000r/min离心15min。取上清液,加入10ml酸性乙醇,边加边搅动。加毕,静置,待RNA沉淀完全后,离心。滤渣先用乙醇洗两次,每次用10ml。再用无水乙醇洗两次,每次10ml,洗涤时间可用细玻璃棒小心搅动沉淀。最后用布氏漏斗抽滤,沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量,计算:

干酵母粉RNA含量(%)=RNA重(g)?100%干酵母粉重(g)

二、RNA组份鉴定

取2g 提取的核酸,加入1.5M硫酸10ml, 沸水浴加热10分钟制成水解液,然后进行组份鉴定。

1.嘌呤碱:取水解液1ml 加入过量浓氨水。然后加入1ml 0.1M硝酸银溶液,观察有无嘌呤碱地银化合物沉淀。

2.核糖:取水解液1ml, 三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液0.2ml。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变成绿色。

3.磷酸:取水解液1ml,加定磷试剂1ml。在水浴中加热观察溶液是否变成蓝色。 思考题:

1.为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解? 2.如何从酵母中提取到较纯的RNA?

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实验十五、酶的性质

一、实验目的

1.通过本实验观察、验证酶的专一性和温度、pH、激动剂及抑制剂对酶活性的影响。 2.熟悉淀粉及其酶解产物的特殊显色方法;电热恒温水浴的使用。 3.了解唾液淀粉酶的收集与预处理。 二、实验原理

酶具有高度专一性,一种酶只能催化一种或一类底物发生反应,如淀粉酶只能水解淀粉,不能水解蔗糖。当淀粉被淀粉酶彻底水解为还原性麦芽糖和葡萄糖时,能使班氏试剂的Cu2+还原成Cu1+,生成砖红色Cu2O沉淀。淀粉酶的活性受温度、pH、激动剂及抑制剂、酶浓度以及作用时间等多种因素影响,因而水解淀粉生成一系列分子大小不同的糊精。不同程度的水解糊精可与碘反应生成紫色、棕色或红色络合物。通过上述特征性反应,并以蔗糖等作对照,便可观察、验证淀粉酶是否具有专一性以及它的催化活性是否受到影响。 三、试剂和器材 (一)、器材

1、滴管、烧杯、试管(架)及试管夹 。 2、恒温水浴箱与水浴锅。 3、脱脂棉、漏斗及纱布。 4、白瓷反应盘 (二)试剂

1、1%淀粉 称取淀粉1g,加少量水调成糊状,加入煮沸的0.3%NaCl溶液至100m1。 2、1%蔗糖溶液

3、班氏试剂 A液:取柠檬酸钠173g,无水碳酸钠100g,加水600ml,加热溶解,冷却后稀释至850ml;B液:取结晶硫酸铜(CuSO4·5H2O)17.3g溶于100ml预热的蒸馏水中,冷却后加水至150ml。将A液缓慢倒入B液中混匀置试剂瓶备用。

4、碘液:称取碘4g、碘化钾6g溶于l000ml蒸馏水中,置棕色瓶内贮存备用。 5、各种pH缓冲液

(1)pH6.8缓冲液:取0.2mol/LNa2HPO4溶液772ml,0.1mol/L柠檬酸溶液228ml混合即成。 (2) pH4.0缓冲液:取0.2mol/LNa2HPO4溶液385.5ml,0.1mol/L柠檬酸溶液614.5ml混合即成。

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(3)pH8.0缓冲液:取0.2mol/LNa2HPO4溶液972ml,0.1mol/L柠檬酸溶液28ml混合即成。

6、0.9% NaCl 溶液 7、1%CuSO4 溶液 8、1%Na2SO4溶液 四、操作步骤

(一)、唾液淀粉酶的收集与处理 1.制备唾液

实验者先将痰咳尽,用自来水漱口,以清除口腔内食物残渣,再在口腔内含蒸馏水约15ml,并作咀嚼咕漱运动,3分钟后吐入垫有两层经润湿处理的脱脂纱布的漏斗内,过滤于小烧杯中备用,为与下面稀释唾液相区别,此称制备唾液。 2.煮沸唾液

取上述唾液约2ml,盛入1中号试管中,置沸水浴煮沸5分钟备用。 3.稀释唾液

调整唾液淀粉酶活性,使之在pH6.8、37℃和既无激动剂又无抑制剂条件下,作用5min,水解淀粉至红色糊精为宜。具体做法是取12凹白瓷反应板一块,按下列步骤操作: ①第1排每凹各加1滴制备唾液,12、13、14凹分别加生理盐水1、2、3滴,用滴管采用抽吸法,由稀到浓(14→12)小心混匀各凹,勿使溅入相邻凹中。每混匀一凹便取其1滴放入同列的2排凹中,剩余稀释唾液应全部放回原凹中。

②在盛有不同稀释度唾液的第2排各凹中,均加入4滴缓冲液(pH6.8),2滴1%的淀粉液和2滴蒸馏水,用①混匀法充分混匀,置37℃下5min。

③在第2排各凹中加I液一滴,混匀,观察比较各凹颜色,以浅棕-红色对应的稀释倍数,用生理盐水稀释3ml制备唾液备用。

(二)唾液淀粉酶的专一性以及温度、pH、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活性影响的观察 1、取试管3支编号,按下表1操作

表1 唾液淀粉酶专一性的实验观察

试剂 试管

1 2 3

pH6.8缓冲液 1%淀粉溶液

20滴 20滴 20滴

10滴 10滴 -

1%蔗糖溶液 制备唾液

- - 10滴

5滴 - 5滴

煮沸唾液

- 5滴 -

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将上述各管混匀后,置37℃水浴中保温10分钟,然后每管加入班氏试剂20滴,再放入沸水浴中煮沸约15分钟,观察各管颜色反应,并说明原因。

(三)温度影响酶促反应的实验观察 1.取试管3支编号,按下表2操作:

表2 温度影响酶促反应的实验观察

管号 试剂 1.pH6.8缓冲液 2.1%淀粉溶液 3.预热5min 4.直接加入稀释唾液,立即混匀、计时 5.保温10min 1 20滴 10滴 37℃水浴 5滴 37℃水浴 2 20滴 10滴 沸水浴 5滴 沸水浴 3 20滴 10滴 冰浴 5滴 冰浴 2.将一、二管移入冰水浴中,待各管温度一致后速向各管加入碘液1滴,混匀后观察各管颜色的区别,并说明温度对酶促反应的影响。

(四)、pH影响酶促反应的实验观察 1. 取试管3支编号,按下表3操作:

表3 pH影响酶促反应的实验观察

试管1 试管2 试管3

pH4.0缓冲液 pH6.8缓冲液 pH8.0缓冲液

20滴 - -

- 20滴 -

- - 20滴

1%淀粉溶液 稀释唾液

10滴 10滴 10滴

5滴 5滴 5滴

2.将上述各管混匀后,置37℃水浴中保温10分钟,然后每管加入碘液1滴,混匀后观察各管颜色的区别,并说明pH对酶促反应的影响。

(五)、激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察 1. 取试管4支编号,按下操作:

表4 激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察

管号 1

pH 6.8 缓冲液 20滴

1%淀粉溶液 10滴

蒸馏水 10滴

0.9%NaCl -

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1% CuSO4 -

1%Na2SO4 -

稀释唾液 5滴

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