实验七 动物骨髓细胞染色体标本的制备与观察
【实验目的】
（1）掌握动物骨髓细胞染色体标本的制备技术 （2）观察染色体的数目以及形态特征 【实验原理】
骨髓细胞具有丰富的细胞质和高度的分裂能力，因此不必经体外培养，也不需要植物血球凝集素（PHA）的刺激，可以直接观察到分裂细胞。经过秋水仙素处理后，分裂的骨髓细胞被阻断在有丝分裂中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，便可制作出理想的染色体标本，是研究动物细胞遗传学的好材料。骨髓细胞染色体标本的制备，具有取材容易，方法简单易行等优点，设备也简单，在一般的实验室都可进行。 【实验仪器、材料和试剂】 1.仪器：
天平、低速离心机、恒温水浴锅、显微镜、1ml注射器、解剖盘、解剖剪、刀片。试管架、10ml离心管、吸管烧杯、量筒。酒精灯、冰冻载玻片、玻璃板、吸水纸、擦镜纸 2. 材料
小白鼠或无尾两栖类青蛙或蟾蜍 3. 试剂
1）Carnoy固定液（新配制的甲醇：冰醋酸＝3:1）
2）0.1％秋水仙素：称取10mg秋水仙素，加入10ml的0.65％生理盐水（1ml含有1000ug，0.1ml含有100ug秋水仙素）；
3）0.85%生理盐水；柠檬酸钠溶液；0.4%KCl溶液（0.075M） 4）0.0667mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）
A液：1000ml含Na2HPO4 9.465 g或 Na2HPO4·2H2O 11.876g 或Na2HPO4·12H2O23.88g B液：1000ml含KH2PO4 9.07g
取A液80ml+B液20ml混匀成pH7.4
5）1:10 Giemsa磷酸盐缓冲液
Giemsa母液：Giemsa粉0.5g，甘油（AR级）33ml，甲醇（AR级）33ml
先将少量甘油加入研钵中，将Giemsa粉充分研细，再倒入剩余甘油，并在56℃温箱中保温2h，然后再加入甲醇混匀，储存在棕色瓶中。 【方法与步骤】
1.骨髓细胞制备如下表
步骤
（1）秋水仙素注射
小鼠 两栖动物
按4ug/g体重注射 按30ug/g注射 3～4h后处死 7～8h后处死
（2）取后肢胫骨和股骨，切去两端。 （3）取骨髓细胞 2%柠檬酸钠溶液1ml 1%柠檬酸钠溶液1ml
用1ml注射器吸取柠檬酸钠溶液，通过针头将溶液注入骨髓腔，冲出骨髓细胞置10ml离心管中（细胞冲净后骨髓腔由粉红变为白色）；摘掉针头，用注射器筒轻轻反复吸打，使分散成单个细胞。 （4）低渗处理 预热及低渗水浴温度：37℃ 预热及低渗水浴温度：26℃
低渗时间：30min 低渗时间：30min
视细胞多少加入7～9ml 预热的0.4%KCl溶液，在水浴中低渗处理。
2. 1000rpm离心8min。
3. 弃上清，沿离心管壁缓慢加入新配制的甲醇：冰醋酸（3:1）固定液5ml，注意不要冲动细胞团块。加完后立即用吸管将细胞轻轻吸打均匀，静置固定20min。如此反复固定2～3次，每次20min。
4 固定的细胞经离心后，吸去上层固定液，视管底的细胞多寡加入少量新配制的固定液，细胞团块轻轻吸打成悬液（注意：吹打不要过于用力）。
5. 在干净并预冷的载玻片上滴2～3滴细胞悬液，干燥。（注意：滴片时滴管离载玻片有一定高度有助于染色体分散）
6. 将玻片细胞面朝上水平放置，滴加1:10 Giemsa磷酸盐缓冲液3～4ml，染色10min。 7. 冲洗掉染液，干燥后镜检。
【实验结果】
1、现象观察：在光学显微镜下，由于对小鼠注射了秋水仙素，能够清楚地观察到分裂中期的染色体。 2、图片
见图7.1
【实验总结】
通过本次实验，学会了解剖小鼠腿的方法，并通过注射骨髓的方法以获得染色体的方法。掌握了将悬液于一定高度处滴落于载玻片的方法，此法有利于染色体在载玻片上分散开来。
实验八 酵母活性的检测
【实验目的】
掌握检测细胞活性的原理和方法。
【实验原理】
美兰（次甲基蓝）染色法对啤酒酵母活性检测简单易行，应用广泛，该染色法主要是利用细胞膜的完整性与新陈代谢的能力说明细胞活性。活酵母细胞内具有还原次甲基蓝呈无色的一种还原酶，当酵母细胞浸于美兰溶液时，色素渗入细胞内，活细胞内的还原酶能使其脱色，但死细胞内的还原酶由于失活，不发生脱色作用，故被染成蓝色。
台盼兰是细胞活性染料，常用于检测细胞膜的完整性。正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。因此，借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。
TTC 即2,3,5-氯化三苯基四氮唑，可以用来测定脱氢酶的活性。在细胞的线粒体中四氮唑从电子传递链上接受电子形成三苯基甲腙，其为脂溶性物质，形成后随即插入线粒体膜中，从而使原来无色的线粒体变成红色。细胞活力强，有氧呼吸旺盛，这种转化能力就强，红色深；而死细胞新陈代谢停止不能使四氮唑转变成三苯基甲腙衍生物，细胞不着色。此法常用于悬浮培养细胞等材料整体活力检测（分光光度法），在单个细胞活力检测中较少用。
詹纳斯绿B(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引而堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。
【材料与方法】
1.1材料：液体培养酵母。
1.2 仪器：倒置显微镜（生物显微镜），低速离心机，血球计数板，15mL离心管，试管，移液管，盖玻片，滴管，香柏油等。 1.3 试剂及配制方法：
1）2%二水合柠檬酸钠次甲基蓝溶液（含有0.01%的次甲基蓝）：次甲基蓝 0.01g，二水合柠檬酸三钠2g，用蒸馏水定容至100ml。
2）0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)：0.2mol/L NaH2P04 39mL与0.2mol/LNa2HPO4 61mL混合再稀释至200mL。
3）0.2%的TTC溶液：称取0.2gTTC，先用少量乙醇溶解，再加2%二水合柠檬酸钠溶液至100mL。现用现配，避光冷藏保存备用。
4）0.1%台盼兰溶液：0.1g台盼兰溶于100 mL0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中，过滤或离心除去杂质。冷藏备用。
5）1% 詹纳斯绿B染液，用生理盐水制备。或称取50mg詹纳斯绿B溶于5ml Ringer溶液中，稍加微热(30℃～40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为l％。Ringer溶液为0.85g氯化钠、0.25g氯化钾、0.03g氧化钙溶于100ml蒸馏水。最好现用现配。
【实验步骤】
1）美兰染色法步骤
配制不同生长状态的酵母样品（如：振荡有氧培养酵母，静置发酵培养酵母，老化发酵液等），用蒸馏水调整细胞总数在(30-60)×106个/ml。
染色液与酵母样品液等量混合，染色5min。
用血球计数板做水封片，显微镜下计数染色细胞与总细胞数。重复3次。 细胞活性=活细胞数/总细胞数*100% 2）台盼兰染色步骤：
晃动悬浮培养物，稍静置，吸取上层悬浮液，在倒置显微镜下观察细胞，用缓冲液调到合适观察的细胞密度，加入几滴0.1％台盼兰溶液，用滴管混合均匀，5分钟后显微镜下观察，计数100个细胞的染色情况，重复3次，计算存活率。 3）TTC染色步骤：
吸取不同培养期的培养物8mL，以1000转/分离心10分钟。
小心吸去上清液，加入0.4%的TTC溶液5mL混匀，30℃下染色1小时。
在显微镜下观察细胞染色情况，计数100个细胞的染色情况，重复3次，计算存活率。
【实验结果】
1、现象观察：美兰染色，活细胞不被染色，死细胞被染成蓝色；
台盼蓝染色，活细胞不被染色，死细胞被染成蓝色； TTC染色，活细胞被染成红色，死细胞不被染色；
詹纳斯绿B染色使线粒体呈现蓝绿色，而胞质显无色。
细胞活性检测：
1、衰老细胞=0/159*100%=0 2、静置=18/72*100%=25% 3、震荡=109/122*100%=89%
【作业与思考】