南京林业大学 植物组织培养笔记(完整)

分为一倍单倍体、多倍单倍体。

二、 单倍体细胞的历史

1、 Tulecke(1950):首次成功地培养科数种裸子植物成熟的花粉粒,大部分花粉可发育成成熟地花粉,另

一些发育愈伤组织。

2、 Yamada(1963):首次报道优紫露草属植物的花药中分离得到了单倍体组织。 3、 印度地Guha和Maheshwari(1964)

成功将曼陀罗成熟的花药培养在适当的培养基上,发现了花粉能转变成分裂状态,从药室转化中长出了胚状体,获得单倍体植株。 4、 我国单倍体育种

1971年中科院遗传所对水稻的花药培养获得了水稻幼苗,在小麦培养中获得单倍体植物。 5、 花粉培养

始于1953年,Tulecke诱导了银杏的花粉获得愈伤组织。另外在天仙子 颠茄、小麦等获得花粉植株。

6、 该技术在10个科、24个属、34个种的250种植株上达到了发展。

三、 花药、花粉细胞培养的应用价值

(1) (2) (3) (4) (5)

在植物育种中使后代迅速纯合 单倍体选择效率比二倍体高 排除杂种优势对后代选择的干扰

遗传研究中良好的实验材料体系;数量遗传、研究细胞分裂极分化 突变体筛选

Hamada(1999)用离子束处理烟草的花药,接种马铃薯病毒,从472株花药再生植株中获得15株抗病植株。

(6) 消除致死基因 (7) 选育新的自交系 (8) 遗传转化的受体材料

第三节 花粉培养

1、 优点:(1)花粉培养可得到单倍体

(2)可观察到单个体细胞开始雄核发育的全过程

(3)花粉能均匀地接触化学的物理的诱变因素,因而花粉是研究吸收、转化和诱变的理想材料。 (4)能从每个花药得更多单倍体植株

2、花粉分离培养时期:花粉在单核时对于诱导雄核发育的外界刺激最敏感。 3、花粉分离的方法:

(1)自然散落法:将花蕾消毒后,取出花药,接种在培养基上,,当花药开裂时,花粉散落在培养基上。将花药去除。但效率低,一般不采用。

(2)机械挤压法

挤压花药:用平头大玻璃棒反复轻轻地挤压花药。

过滤收集:用200目的镍丝网过滤,使花粉进入滤液中心。

离心清洗:把滤液放入离心管中,在200r/min速度下离心数分钟,使花粉沉淀,吸取上清液,再加培养基悬浮,然后离心。反复3—4次。 把洗净的花粉沉淀:加入一定量的培养基。 (3)破裂释放法:用工具破裂花药。 4、花粉预处理

(1)低温处理:可以明显提高花粉胚的诱导率。例曼陀罗的花蕾连同花梗一起采下,将其插入水中,于3℃保存48h,促进花胚的产生。烟草的花药低温预处理在7—9℃下进行,处理时间7—14天为宜。

(2)离心处理:处理烟草单核后期的花粉再生频率从30.5%提高到38.2%。

(3)乙烯利处理:在减数分裂前用乙烯利喷施植株促使花粉细胞核分裂,促进愈伤组织形成。

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还有利用辐射、高温、变温、黑暗或生长素等处理,对于培养也有好处。 5、花粉培养 (1)平板培养法 (2)看护培养法

(3)条件培养法:合成培养基中加入失活的花药提取物,然后接入花粉进行培养。 6、花粉植株的倍性鉴定方法

(1)气孔保卫细胞长度:单倍体气孔保卫细胞长度60um以下,二倍体大于65um,标准率在90%以上。 (2)叶绿体数:染色体倍性与气孔保卫细胞叶绿体数相关。 (3)细胞染色体数:采用根尖,镜检染色体直接计数。 7、染色体加倍

(1)自然加倍 离体培养过程中染色体自然加倍的现象得到二倍体纯合,可通过培养基成分、温度等条件调控。

(2)人工加倍 采用物理方法如加热冲击、伽玛射线冲击法

第四节 花药培养

一、 花药培养的一般程序

1、 材料的选取:以单核中、晚期花粉为宜,接种前用醋酸洋红、I-KI溶液等染色压片法,确定花粉发

育的时期,如果花药白色,则过嫩。 2、 处理的预处理:同花粉处理。

3、 材料表面灭菌:70%—75%酒精在表面浸一下在饱和的漂白粉溶液中,浸10—20分钟或0.1L消毒

7—10分钟,用无菌水冲洗。

4、 接种:每管接种30—60粒,接种密度高些好。

5、 培养:一般先在暗处培养,待愈伤组织形成后在移植光下培养,温度为25—28℃。 6、 花粉植株的移植:烟草每个花药上可产生200株以上的花粉植株。 二、花药培养方法

(1)琼脂固体培养基:在培养基加入0.5%-0.8%琼脂,浓度一般以花药有1/3浸入而不沉没于琼脂中为宜。

(2)液体培养法:在培养基中不加入琼脂,直接把花药接入呈液体状态的培养基中。液体培养基是一薄层(约0.5cm液层)

三、影响花粉培养成功的因素

1、材料的基因型 不同的植物,对花培的反应极为不同。一般茄科的植物花药培养容易成功,而棉花、大豆的花药培养至今尚未成功。

2、花粉的发育时期 接种花药的花粉发育时期,是决定花药培养能否成功的关键因素。如水稻、烟草的花粉,从单核中期到双核期皆可接受诱导,而小麦、玉米的花粉,以单核中期为佳,番茄、大麦则还要更早。

3、培养基的作用

(1)基本培养基:主要是MS、N6、B5、Miller、Nitsch等

(2)植物生长调节剂:在培养基中,起关键作用的主要是激素。生长素与分裂的比例决定愈伤组织的分化程度。

(3)糖对于花药培养的作用:主要是提高碳源和调节渗透压的作用。在烟草的花药培养中,蔗糖的浓度在1%—3%的范围内。当浓度达到3%时出苗率达到39.06%。当浓度达到4%时,出苗率降到17.72%。在花药培养中,蔗糖浓度一般以2%—5%为宜。在分化培养基中,蔗糖的浓度不宜太高,一般在3%左右,太高不利于苗的分化。特殊情况:大麦、小麦等需要9%左右。

(4)有机附加物:促进花粉发育也有着一定的作用。例如:水解乳蛋白(LH)、水解核酸(RH)、酵母提取物(YE)和谷氨酰胺等。

(5)活性炭的作用:促进花粉中愈伤组织和胚状体形成的作用。例如1%的活性炭,使烟草花药出苗率提高1—4倍。0.5%的活性炭,使玉米花药中愈伤组织或胚状体的诱导频率提高1倍左右。

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(6)培养基中PH值对培养效果的影响:当PH值达到5.8时,效果最好。PH值达到6.5时,花粉不形成胚状体,经镜检,未看到花粉发生细胞分裂。

(7)植株的生理状态:开花后期的花药不宜培养;缺N植株的花药易培养。

(8)条件培养基的作用:指植物组织培养可分泌某些物质进入培养基,使得培养基条件比,成为条件培养基。

思考:花药培养的意义;花粉的培养方法;花药培养方法。

第七章 原生质体培养及融合

第一节

一、原生质体的优点及意义

原生质体:把植物细胞除去细胞壁裸露的部分。 优点:(1)每个原生质体都含有该个体的全部的遗传信息,在适当的条件下,具有再生成与其亲本相似个体的细胞全能性。

(2)在同一时间内获得的大量原生质体在遗传上是同质的,可为细胞生物学、发育生物学、细胞生理、细胞遗传学及其他生物学科提供良好的实验体系。

(3)通过异源原生质体的融合,开展植物体细胞遗传远缘杂交不亲和机理等方面的研究,培育出具有优良经济性状的新品种。

(4)比完整细胞易于摄取外源物质。

总之在遗传转化、改良作物品种、生物学的基础研究有广泛的用途。

第二节 原生质体的分离及纯化

一、原生质体的分离

分为两步:先除去胞间层,游离出单个细胞,再除去各个细胞的细胞壁。 (1)机械法:将细胞放在高浓度的糖溶液中。

缺点:操作繁琐,产量低;只用于液泡分化程度较高的细胞或长形的细胞。很少使用。 (2)酶法:

所用浓度:纤维素酶浓度在0.5—3.0%,也较多的使用纤维素和果胶酶,柑橘用3%的果胶酶和纤维素酶获得较好的效果。分离原生质体所需的时间:短至30min,长至20h,一般在4—24h之间。

二、原生质体培养的材料来源

1、天然材料:包括田间栽培或野生的树种

(1)幼嫩叶片 是分离原生质体的号材料,取材方便,来源广泛。

(2)取材时间 一般在冬末春初时,可从幼树上切去40—50cm长带有休眠芽的枝条插在自来水中,并放置在生长室8—10天,就可以萌发出幼嫩叶片。

另外根、茎、子叶、下胚轴、果实等都可作为分离原生质体的来源。 选择合适的基因型、生理状态时培养成功的关键。

2、 人工培养材料

(1)无菌苗的子叶 无菌苗的子叶分离原生质体,不仅省略了表面灭菌的程序,而且获得较高产量的原生质体。

(2)愈伤组织或悬浮培养细胞 愈伤组织或悬浮培养细胞,是最广泛使用的原始材料。这些材料不受环境条件的影响,试验重复性好,分离的原生质体在产量上比幼叶或子叶的产量高。

缺点:需要多次继代后才适于用来分离原生质体。

取处于指数生长期悬浮培养细胞,不仅分离原生质体容易,而且可以获得大量有活性的原生质体。

选材注意的问题:1、选择具有形态分化潜力的材料,易于器官发生。

2、选择经过酶处理后可以达到大量原生质体的材料,使产量维持较高的水平。

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3、原生质体稳定性好,不易破碎。 4、原生质体活性高,可持续分裂。

三、细胞壁降解酶的种类和方法

降解细胞壁常用的酶有果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶。

果胶酶是从根霉中提取的,用果胶酶可使细胞间的果胶降解,把细胞从组织中分离出来

纤维素酶是从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂,其主要作用是降解细胞壁中纤维素,得到裸露的原生质体,此外,还常用的是半纤维素。

所需浓度:体积比通常1g鲜重,用10ml酶液。

注意:没混合液不能用高压灭菌,因酶被经高温会失活,必须采用微孔滤膜对酶混合液作过滤灭菌,常用的过滤膜孔径为0.45u。

PH值为4.7—6.0为宜。烟草分离原生质体需要两个PH值,一个是4.7,一个是5.7。 酶解温度最适25—30℃。

酶解时间:最短30min,长至20h。

四、 渗透压稳定剂

原因:细胞壁被酶解时原生质体内和原生质体外渗透势不平衡,会使原生质体胀破,最好用等渗溶液,使细胞处于微弱的质壁分离状态,有利于细胞壁的分解。

常用的渗压稳定剂:糖溶液系统和盐溶液系统。 糖溶液系统:甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖。 盐溶液:KCl(2.5%)、MgSO4.7H2O(1%)、KH2PO4或CaCl2等。 国内用的较多的是甘露醇、甘露醇与蔗糖的混合液。 盐溶液作渗透剂,优点:稳定原生质体、提高酶效等。 缺点:在培养时原生质体形成假壁。

最佳方法:先用盐作渗透剂,在培养原生质体时改用有糖溶液。

五、 原生质膜稳定剂

分离原生质体时,可以加入适量葡聚糖硫酸钾(0.2—0.3%)

氯化钙(0.1—10mmol/l) 磷酸氢二钾等化合物

上述对原生质膜起稳定作用,可增加完整原生质体的数目。 六、原生质体的分离

原生质体的分离步骤: (1)两步法

第一步:先洗净叶片,灭菌后,用镊子撕掉表皮,切成小块(约2g)浸泡于20ml0.5%果胶酶(附加葡聚糖硫酸钾0.3%、甘露醇0.7mol/l、氯化钾0.1—10mmol/l,溶液PH值为5.8)的溶液中,开始抽气减压3分钟,让酶液渗入组织以降解细胞间的果胶,将材料分离成单细胞,再通过离心收集细胞。

第二步:加入2%的纤维素酶,保温2—3h,酶液用甘露醇、氯化钙等配制(浓度同上),PH值为5.4,以降解细胞壁,释放原生质体。

如:白杨实生苗采用两步法,获得了高产量原生质体,每克鲜重组织得5.4x10 个原生质体。 (2)一步法 目前较为普遍适用的方法。

将果胶酶和纤维素酶混合使用(每克叶片加20ml酶液)结果仅一步既降解了中胶层,分解了由细胞壁而释放出原生质体。

对愈伤组织和悬浮培养细胞,根据情况稍加修改。

第三节 原生质体的纯化和活力测定

一、原生质体的纯化

沉降法 利用比重原理。

漂浮发 使用了比原生质体比重大、渗透压较高的溶液,使原生质体浮于溶液表面。 界面法 原理是两种比重不同的溶液,使健康和完整的原生质体处在两液相的界面之中。

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