六、 悬浮细胞的生长测定
（1）细胞计数 :计数前需将细胞团中的细胞游离出来。可用5%的三氧化铬20℃下离析6h。 血球计数板的用法：
深度0.1mm,共有25格，每个大格有16个小格，每个区域400个小格，每个小格的面积为1/400mm2 .
每次计25个大格中的细胞数。也可计算4个角上的大格数，加中央大格内的细胞数计算：细胞数/ml=5个大格内细胞总数х5 х10000х稀释倍数 （2）细胞密度体积（packed cell volume,PCV）:将一定量的细胞悬浮液放入15ml刻度离心管中，于2000 х
g离心5min,以每毫升培养液中细胞总体积的ml 数表示。 （3）细胞鲜重：抽滤去粘着的多余水分，称重。 （4）细胞干重：烘干重（60℃ ）
（5）活细胞率的测定：活细胞的百分率可作为细胞悬浮培养时的起始密度的参考。 方法： 0.1%酚藏红花
水溶液，丙酮配制二醋酸酯荧光素母液 。活细胞不染色具荧光，死细胞染色不具荧光。 （6）有丝分裂指数：处于有丝分裂的细胞数占总细胞数的百分数。一般为3~5%
荧光素双醋酸酯法（ FDA）法的原理 ? FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以自由出入细胞膜。 ? 在活细胞中，FDA被酯酶裂解，释放出有极性的荧光素。 ? 荧光素不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。 ? 荧光素在死细胞中不能积累。 ? 在UV照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧光。 第三节、植物细胞大规模培养
一、分类：分为分批培养和连续培养 1.分批培养/成批培养（Batch culture）
含义：将愈伤组织培养分散在一定容积的密闭容器中进行培养。一般为100~250ml 的三角瓶，每瓶咱上能
够右20-75ml培养基。在培养期间,系统内的培养物既不能添加也不能放出。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。
分批培养的特点：在密闭的容器中，培养基体积固定。培养过程中，细胞生长，其数目不断发生变化，呈
现出明显的由慢到快，再到慢，最后增长停止的细胞周期。细胞的生长呈S型曲线。必须适当搅拌。当营养物质耗尽时，细胞的分裂即停止，需进行继代。
分/成批培养容器种类：成批培养容器种类很多,如单硫酸瓶培养系统,双硫酸瓶培养系统,旋转烧瓶培养系统、三角瓶等等. 微生物发酵罐进行植物悬浮细胞大规模培养,发酵罐的型号多种多样,体积有大有小,从几十升到上万升 。
2 半连续培养：半连续培养是一种定时进出装置的开放型的成批培养系统.每天或每2d时间收获一部分培
养物,然后再加入新鲜培养基,并保持培养细胞数量的恒定.特点：这种培养系统可在较长的时间内使培养细胞处于对数期生长.
3 连续培养 ：连续培养,包括封闭式和开放式两种培养类型 (1)封闭式连续培养：是使培养细胞保持在一个反应器中,在培养过程中不取出培养细胞,而是定时注入定量的
培养液和排除等体积的培养物,使培养体积保持不变,单细胞的数量不断增加.
开放式和封闭式区别
?封闭式中：排出液中的细胞用机械方法
收集后，又放入原培养基，所以其培养细
胞数目不断增加；
?开放式中：在注入新鲜培养基的同时，
培养细胞随同培养液一起流出，培养细胞 数目保持恒定；通过调节流入和流出的速
度，使培养物的生长速度永远保持接近最高值的恒定水平上。17
二、影响大规模细胞培养的因子
（1）植物细胞的体积大小：一般讲，植物细胞的直径为20-150u，比细菌或真菌细胞大30-100倍左右，所
以植物细胞培养时的密度比微生物更为密集。聚集的细胞生长慢（成批培养需2-3周，而微生物发酵只需几天时间），细胞的异质性增加（发育周期不趋同步）。
（2）植物细胞的重力影响：与微生物相比，植物细胞显的大而重，悬浮培养时很容易沉降，如果反应瓶内
搅拌不能达到标准要求，就会有大量细胞堆积起来。气升式培养容器，适合于大规模培养植物细胞，它既有较好的通气效果，又不会把植物细胞撕裂打碎。
（3）pH的影响：在植物细胞培养中，细胞最适合生长的pH值在5-6范围，但在培养过程中往往会发生pH
值的改变 ,变得较小。在反应器上装有pH值探头，可随时检查培养液中pH的变化而给予调整。 （4）机械搅拌的剪切力：机械搅拌会有较大的剪切力，对细胞造成较大损伤 第四节 单细胞培养技术 一．单细胞分离
1、由完整的植物器官分离单细胞（1)无菌的幼苗和吸胀的胚胎：放在手动的玻璃匀浆器中，破碎其软组织，
放入液体培养基中培养。(2) 叶片是分离单细胞的最好材料:机械法(用刀片刮叶片,叶片研碎、离心),酶解法(用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞) 机械法和酶解法比较：机械法：（1）细胞不受到酶的伤害；（2）不用质壁分离；（3）细胞产量低；（4）细
胞易破。 酶解法：（1）细胞受到酶的伤害；（2）要质壁分离；（3）细胞产量高；（4）细胞不易破。 2、由培养组织中分离单细胞（1） 诱导产生愈伤组织；（2） 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高
愈伤组织的松散性（3）（Suspension culture)将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物.优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流(4) 愈伤组织中分离：放入液体培养基用旋转式摇床（100~110转/分）振荡振荡培养；向细胞悬浮液中通入脉冲压缩空气分离细胞。。 二．单细胞培养
1.将植物游离的单细胞培养 获得单细胞克隆 经特殊的培养进一步分化出再生植株 2.该技术是植
物组织培养研究中的一项重大成就 。3.单细胞培养的植株也为跟踪和研究离体细胞的分裂、生长、分化提供了机会。 （一）固体培养
1 平板培养（cell plating）
具体方法：将含有0.6%~1.0%的琼脂培养基冷却到35℃时（尚未固化）；将悬浮液（要除去全部组织块和大
的细胞团）接种进去，充分混合，倒入培养皿中，约铺成1mm厚薄层，培养皿用塑料膜封口；在25℃暗处保温培养，定期用显微镜观察细胞是否开始分裂或生长成小群体。形成小群体的可继代在新鲜培养基上。
平板培养的植板率高低随细胞种类、接种密度及培养基的成分不同而不同，细胞接种密度，一般不能低于
103~104个/ml细胞。 2 看护培养(nurse culture）
方法如下：将游离的植物细胞置于一小块覆盖在活跃生长的愈伤组织之上的滤纸上进行培养。原理：生长
中的愈伤组织的某些成分分泌产物可以刺激细胞的分裂，起到监护培养的作用（nurse effect） 3 调理培养（condition culture）
与监护培养相同的原理，1955年Ropp 应用此法：在选用的培养基中，加入一定量的已生长过组织和细胞
的培养液，离心除去组织或细胞，称为调理培养液；用调理培养基培养细胞，即使接种的细胞密度低于最低的有效密度，这些细胞也能生长和分裂。这种调理培养可以大大地降低有限的平板密度。 （二） 液体培养
1 微滴培养：Ropp(1955)最早使用悬滴培养技术，后不断改善微滴（microdrop）培养技术。优点：便于在
显微镜下连续观察细胞地变化，但微环境易蒸发和受细胞代谢的影响而发生改变。成功率较平板培养低。
2 液体浅层培养：液滴浅层培养是先在培养皿中注入浅层培养基，再接种上已分散的单细胞。上述两种方
法主要是将单个细胞置于量少的培养液中进行培养，使得细胞产生的活性物质被大量的培养液所稀释，
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从而达到自我激活的效果 。 三、多种方式的综合培养
几个设计思路： (1) 选择有利于细胞培养的培养基（2）利用细胞之间的相互影响，提高植板率（3）使细
胞处于最有利于细胞营养物质的状态（4）减少培养基体积，使得细胞和培养基比值相当。
1固相化培养：固相化培养，使将细胞（或原生质）固着在琼脂糖、藻酛酸盐或多聚赖氨酸中；将它们放入
液体培养基中振荡培养。待细胞克隆出现时，再取出转入固体培养基中培养。
优点:：这种方法即利用了振荡培养时营养物质和气体易于交换的特点，又利用了固相化使细胞内免受振荡
时剪切力的作用。
2 膜室培养：用赛璐玢膜圆筒制成膜室，室内放入欲培养的低密度细胞悬浮液，为双层培养基，下层为高
密度细胞饲喂。效果比调理培养及饲喂培养好。
三、 植物细胞培养的应用：
1.植物体细胞突变体筛选：细胞培养过程中再生植株或后代中会出现变异，是由离体培养引起的，称为体细
胞无性系变异。用于研究遗传育种、突变体筛选提供很好的实验材料。。 2 植物次生物质生产
3 其他应用：代谢生理、细胞生物学、生物化学研究
4 再生植株：将悬浮细胞转移到半固体或固体培养基上，使其增值形成愈伤组织，由愈伤组织再生植株或
体细胞胚。
第五节 生产次生代谢物
一、发展简史：
（1）1956年，Routin和Nickell首次提出了利用植物细胞培养技术生产天然的产物的专利，经不断努力，
多种植物细胞培养技术进入中试阶段和工厂化生产。
（２）1967年Kaul和Staba首次采用多升发酵罐培养小米细胞，并获得了其中的药用成分--呋喃色酮
（Visnagin），这为其后的研究树立了成功的典范。
（3）进入七十年代后，微生物发酵技术的进步与完善为植物细胞大量培养提供了宝贵的经验。
（4）80年代成为该领域发展的黄金时期，科学家们取得了重大的突破。大规模植物细胞培养技术经过几十年的努力研究已取得很大进展。
① 植物细胞大量培养用以生产植物次生代谢物已构成了生物工程的重要组成部分，逐渐完善成一门利用植物细胞体系（培养细胞）
②通过现代的生物工程手段（细胞大量培养、次生代谢物及其调控、细胞突变及其筛选等），进行工业规模生产，以获得各种产品的新兴的跨学科技术（唐建军等1998）。
迄今为止，全世界已对近1000种植物进行过细胞培养方面的研究，生产的天然产物包括药品、香料、色素、食品、化妆品等500多种（常钰等2001
有些药用植物种类已实现工业化生产，如通过希腊毛地黄细胞培养物生物转化生产地高辛；从日本黄连细
胞培养物中生产黄连碱；利用紫松果菊细胞生产具免疫活性的多糖；利用人参细胞培养物生产人参皂甙；利用紫草细胞培养技术生产紫草宁等等。 二、优点：
（1）次生物质的生产是在可控条件下进行的；
（2）可通过条件优化和细胞株筛选得到超越整株植物产量的次生代谢物；
（3）培养细胞是在无菌条件下生长，可排除病菌、虫害和重金属离子等不利因素； （4）可以进行特定的生物转化反应，得到单一的有效成分； （5）可以探索新的合成路线，获得新的有用物质。
（6）该技术不仅节约能源和时间，大大减少占地面积，并且不受地域和季节的影响，保护了那些天然稀有，
生境独特，繁殖能力差的药用植物资源，对于维持生物多样性，保持植被具有一定的促进作用。 三、影响因子：
一般选择叶片，块茎等；高产细胞株的筛选（基因型） ；Saito等人从短叶红豆杉和东北红豆杉的愈伤组
织中筛选到的细胞株，紫杉醇含量达到了0.05%，是原来红豆杉树皮中紫杉醇含量的10倍。
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（一） 培养基的选择：选择适宜的培养基是关键；碳源：普遍使用的碳源是蔗糖；氮源：通常使用NO3 NH4+ 两种形式作为细胞培养的氮源；磷：培养基磷的含量，对细胞处理起着重要的作用；微量元素：促进合成如加入cu2+可促进紫草宁合成高30倍；生长调节物：2，4-D对某些培养物中次生代谢的合成有抑制作用；添加物：李弘剑等人（2001）将果胶酶（0.2%）添加到青蒿素合成培养基中，处理黄花蒿培养细胞2天，青蒿素合成量比未加刺激的细胞提高了3.08倍；植酸、活性炭 稀土，真菌诱导子等。 思考题
1.悬浮培养的特点是什么？ 2.愈伤组织生长的特点有哪些？ 3.如何得到单离细胞？ 4.细胞培养有哪些方法？ 5.如何测定培养细胞的活力？ 6.如何计量培养细胞的数目？ 7.FDA测活力的原理是什么？ 8.如何获得同步化的培养细胞？ 9.影响单细胞培养因素？
第六章 植物花药和花粉培养
第一节 花粉花药的发育
一、花药的组成：
花药是植物花的雄性器官，由两部细胞组成：其一是体细胞，包括药壁和药壁组织细胞；其二是雄性性细胞，即小孢子，一般称为花粉粒。
二、小孢子的正常发育
小孢子母细胞，即花粉母细胞，发育可分为四个时期：
（1） 四分孢子时期：花粉母细胞减数分裂形成。 （2） 单核期：特化的细胞壁形成。 （3） 双核期：第一次有丝分裂形成一个营养细胞核生殖细胞。 （4） 三核期：产生两个精核。
花粉成熟时有一个营养细胞和两个精细胞。
三、离体培养条件下孢子的发育
1、营养细胞发育途径
第一次不均等分裂产生营养核与生殖核，生殖核退化，营养核经过多次分裂形成细胞团，增殖形成愈伤组织和胚状体，再生成植株。 2、生殖细胞发育途径
营养核退化，生殖核多次分裂发育成细胞团。 3、营养核和生殖核同进行发育途径 4、花粉均等分裂途径
第二节 花粉和花药培养的优点
一、 单倍体细胞培养
3个方面：花药培养、小孢子培养、未受精的子房及细胞培养。 花药和小孢子培养是体外诱导单倍体的主要途径。 术语：
花药培养：将植物的花药取出，在离体无菌的条件下，进行培养，属于器官培养。 花粉属于：花药的一部分，以单细胞状态存在与花药的药室中，属于单细胞培养。 单倍体：指具有配子染色体个数的个体，即细胞染色体数为n。
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