2、 操作：在超净工作台上，把已经消毒过的芽放在解剖镜下仔细剥离，直到显出圆滑生长点。 3、 培养 一般用MS培养基。（1）培养的茎尖颜色逐渐变绿，体长，基部逐渐增大，有时形成少量愈伤组织；（2）3-4周后，即可看到由叶原基生长形成小叶和明显伸长的茎；（3）将茎尖转入无生长调节物的基本培养基中，继续培养，最后发育成完整小植株。 培养中可能出现的问题及解决方法：
1） 若生长过自己，应降低生长素浓度或降低温度； 2） 生长太慢的茎尖，应适当调节激素比例。
五、通过愈伤组织培养再生植株去病毒
通过实验发现，感染了TMV的烟草，培养的愈伤组织中只有40%的细胞带有这种病毒，说明愈伤组织中的某些细胞是不带病毒的，可通过愈伤组织培养再生植株的方法，获得无病毒植株。
（1）病毒在植物体内是不均匀的进入愈伤组织；
（2）有些细胞通过突变获得了抗病毒的特征，抗病毒浸染的细胞可能与敏感型细胞一起存在母体组织中。
六、植物脱毒的检测和保存
鉴定病毒的简便方法：1、视觉观察法：观察植物的叶子和茎有无该病毒有的症状。缺点：由于寄主植物的病毒症状要相当长时间才能表现出来，这段时间内无法鉴定是否病毒已去除。 灵敏的测试方法：
1、汁液传染：在供试植物上取下叶片，置于等体积的(w/v)的磷酸缓冲液(0.1mol/L)研磨后待用；用金刚砂轻轻擦破指示植物（对待定病毒极易感染的植物）叶表皮，再用供试植物的液汁涂抹，几分钟后用水浇去残留接种物。
2、叶片嫁接法：取供试植物叶片为接穗叶柄用刀削成楔形，去掉指示植物顶端一小片叶，迅速将接穗小叶嫁接到指示植物上，并用塑料带绑缚结合处，一般4-6月固可鉴定处有无病毒。
3、抗血清反应鉴定法：用已知的病毒的抗血清可以鉴定未知的病毒种类，抗血清鉴定是一种高度专业化型的试剂，特异性高，测定速度快，几小时或几分钟就可完成鉴定，是最有效的病毒鉴定方法。 常用：试管沉淀实验、点滴沉淀实验、凝聚沉淀实验
4、电子显微镜法：在电镜下可观察到病毒颗粒的大小，形成和结构，需要较高的病毒浓度，对不表现可见症状的潜伏病毒，血清和电镜法唯一可行。 5、酶联免疫法
原理：把抗原与抗体的免疫反应和酶的高效催化作用结合起来，形成一种酶标记的免疫复合物，非常灵敏，能检测出10^5数量级的病毒浓度。可同时检测大量的样品。
七、无毒原种苗的保存
1、隔离种植保存:通常无毒原种要在隔离区域或隔离虫网室内种植保存。 2、离体保存：通过组织培养，大量繁殖，长期保存于试管中。
思考题：
1、茎尖培养的意义； 2、茎尖培养的程序；
3、怎样检测植株有没有病毒？
第五章 悬浮细胞培养技术
概述
植物细胞培养是植物生物工程的基础，如植物基因工程要在细胞或个体水平上表达；人工种子，要进行同
步培养;原生质体融合，近几十年发展起来利用细胞培养技术生产次生代谢物的技术都离不开细胞培养
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技术，此外在植物遗传、农林、园艺等学科等得到广泛的应用。
细胞培养包括：悬浮细胞培养（cell suspension culture）单细胞培养（single cell culture）。
悬浮细胞培养：是将植物细胞和小细胞聚集体悬浮在液体培养基上进行培养。其目的是使细胞能保持较好
的分散状态。 具有以下特征：（1）具有较高的分散程度。（2）细胞形态的一致性，大小均一，具有明显的细胞核和致密
的细胞质。（3）较低的分化程度（4）有规律性，通常为24~72小时的细胞加倍周期，（5）对外源激素需求一定程度的驯化（6）细胞全能性暂时性消失。
单细胞培养技术：是将植物的单细胞置于特殊的条件下培养，培养的细胞通过分裂形成细胞团，再经细胞分化形成胚状体、或根、茎、叶等器官，最后长成植株。
第一节 植物愈伤组织培养
一、愈伤组织的概念：愈伤组织（（callus)原是指在植物受伤后伤口表面形成的一团薄壁细胞。在组织培
养中则是指在人工培养基上由外植体组织的增生细胞产生的一团不定形的疏松排列的薄壁细胞。
二、愈伤组织的培养的意义：
(1) 愈伤组织培养是一种最常见的培养形式，除茎尖分生组织和一部分器官培养以外，其他几种植物组织培
养形式最终都要经历愈伤组织才能形成再生植株． (2)愈伤组织还常常是悬浮培养的细胞和原生质体的来源． (3) 由外植体形成愈伤组织，标志着植物组织培养的开始．
三、愈伤组织形成
植物细胞可以摆脱原来的遗传控制和生理制约，在一定条件下，发生回复变化，从而失去分化状态，变为分生细胞，实现脱分化过程，即脱分化过程．
植物细胞的全能性，可以脱分化之后再次分化为完整的植株（即再分化）。
脱分化后的细胞经过连续的有丝分裂，形成愈伤组织．几乎所有高等植物的各种器官离体后都可以脱分化形成愈伤组织。
四、愈伤组织的类型（由异质细胞集合而成）
松脆愈伤组织、致密愈伤组织、有胚性无胚性、优良的愈伤组织
特点：高度的胚性或再分化能力、容易散碎，易于建立优良的悬浮系、旺盛的自我增殖能力，扩大规模、胚性的保持力强，可以长期保持易于遗传操作。 五、愈伤组织形成历程 诱导期(induction stage):
通过一些刺激因素和激素的诱导作用，使接种的外植体的合成代谢加强，迅速积累蛋白质和核酸． 此期间细胞体积变化不大。诱导期长短与种类、生理状态和外部因素有关。如菊芋只需要一天诱导时间 分裂期(division stage)，顾名思义是指经诱导后，外植体开始迅速分裂，结构疏松，个体小，缺少组织结构，
生理生化都发生变化．
形成期(formation stage)，是指经诱导、分裂后，形成了无序结构愈伤组织的时期．即由有序化的过程，化
不同为均一的过程． 这个时期愈伤组织特点的有：
（1）大而不规则，高度液泡化，组织较为松散。
（2）表面以下约5~10个细胞是细胞生长中 心，这些区域是愈伤组织的愈伤组织生长 的中心部位
分化期(diffrentiation stage)：是指停止分裂的细胞发生生理代谢变化，导致形成由不同形态和功能的细胞组成的愈伤组织。
分化期愈伤组织主要表现在有：
（1）细胞分裂部位和方向发生改变，表层细胞分裂减慢，进入组织内部细胞的分裂。 （2）分化组织瘤状结构和微管组织形成。 （3）细胞体积不再减小 （4）出现各种类型的细胞
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（5）生长的愈伤组织一般呈黄色或白色、绿色 或浅绿色。 六、愈伤组织的继代培养：
一般将愈伤组织长到2-3cm2 时将其分离，切成4-8块继续培养。生长迅速的愈伤组织多呈浅色、质地松软。若是愈伤组织分化再生须选择生长慢的愈伤组织。
继代周期：一般4~6周，或3~4周。若继代周期长，愈伤组织会出现褐化。如银杏需在18天内继代一次。 发生部位：愈伤组织生长只发生在不与琼脂接触的部位，接触部位上、极少有增殖。因而会使愈伤组织小
块变成不规则馒头状的组织快。 七、愈伤组织培养条件与定向培养 愈伤组织培养条件： 1外植体
（1）基因型对愈伤组织器官分化有决定性的作用。
（2）通常同一种植物的不同器官或组织所形成的愈伤组织差别均不大。但油菜的花器官较叶、根易于分化
成苗
（3）幼嫩的外植体易于诱导愈伤组织也易于分化成植株。 2培养基
（1）生长调节剂的影响最大。2，4-D 是最有效的愈伤组织诱导剂。浓度一般在0.1~10mg/L，生长素/分裂
素型的比例决定愈伤组织器官的分化 （２）无机盐 （３）有机物
（４）培养基的物理性质：固态、液态，ＰＨ等 3培养条件：光照、温度２２～２５度 不同用途愈伤组织的定向诱导 愈伤组织生长类型：
（1）生长素型，愈伤组织较为松脆，生长在旺盛是进行悬浮培养最适合的材料。 （2) 生长素/分裂素型
（3) 细胞分裂素型，愈伤组织较为坚硬。坚硬的愈伤组织细胞间被果胶质紧紧粘着，生长慢，不能形成很
好的悬浮系统。，但易分化苗。
控制愈伤组织定向转变的因子主要是激素和氮源。 还原态氮促进分裂作用。硝态氮抑制分裂。 八、愈伤组织生长规律:
继代后在3-7天内即可恢复生长 2~3周内愈伤组织处于旺盛时期 生长达到顶峰并随之缓慢下来（愈
伤组织块达到最大体积。） 即慢 快 慢
继代培养的最合适时间：是在愈伤组织生长快达到最大体积的时间.即在愈伤组织生长即将达到顶峰之前， 九、愈伤组织形态发生方式 １、器官发生发生：
（１）愈伤组织形成无根的芽或无芽的根 （２）先形成芽再在芽基部生根，较为普遍 （３）先形成根再分化芽，较为困难。
（４）先在愈伤组织临近不同部位分别形成芽和根，再形成植株。 ２、体胚发生:
第二节 悬浮培养体系的建立及培养 一、悬浮细胞的特点
1、细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；
2、能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。 3、悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。 二、起始悬浮液的制备
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三、悬浮细胞生长曲线 呈S型生长曲线。
（1）延迟期（lag phase）:细胞分裂少，维持1-2d.
（2）对数生长期（exponential growth）:细胞数目上迅速增长； (３)直线生长期（linear growth phase):
(4) 缓慢期（滞缓期）(decdlerational phase)：增殖缓慢。 (5)静止期（stationary phase）:细胞增长完全停止.
延迟期的特点：其长短与继代时细胞生长状态和转入的细胞数量有关。细胞数少，延迟期长，密度低，细
胞很难生长。 继代的方法和最佳时期
继代方法： 用注射器或移管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。
最佳继代时期：若缩短继代时间的间隔，每个2-3d 继代一次，则可使悬浮培养细胞一直保持对数生长。处
于静止期的细胞进行继代，细胞会大量死亡和解体。 一般选择对数生长期和直线生长期的细胞进行继代。 四、影响悬浮细胞培养的因素 1. 起始愈伤组织的接种量：
是影响悬浮培养建立质量的第二个主要因素，如烟草中愈伤组织的接种量 为100ml 2~3 g 湿重。 2. 愈伤组织的疏松度（friability ）是建立悬浮细胞培养的关键条件（激素调控） 3. 培养基的成分一般用MS或B5、ER(无机盐较高），然后稍加改变无机及有机成分。低浓度的氮刺激细胞
分裂形成小细胞，高氮利于细胞生长。其他成分：
4. 细胞起始密度：起始密度，一般在0.5~2.5×105 细胞/ml ，在培养过程中可增加到1~4×106， 18~25d
平均每个细胞分裂4~6次，。
5.培养基的振荡频率：使单细胞或细胞团分散，有利于气体交换。转速一般为60-150r/min.起初机械振荡至
少达到100~120转/分，悬浮培养建立后速度可以适当降低。 6.继代周期：一般20d左右。 五 、悬浮细胞的同步培养
细胞同步培养（synchronousdivision）：使细胞分裂的同步化。有物理方法和化学法。 物理方法
（1）体积选择法：根据聚集体大小选择，萝卜体细胞胚同步化达到90%. （2）冷处理法：低温刺激提高同步化程度。 化学方法
（1）饥饿方法 ：培养基中林和糖类物质饥饿可阻止G1期和G2期。重新加入成分可获得同步培养
（2）抑制方法：一些DNA合成的抑制剂，如5-氨基尿嘧啶，或胸苷嘧啶核苷酸抑制处理后 ，使细胞同时
处于G1期和 S 期
（3）有丝分裂阻抑：加入秋水仙碱组织细胞停留在中期。
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