2．测定维生素B2片剂在人体内的生物半衰期与绝对生物利用度。
二、实验原理
尿药数据法与血药浓度法一样，也可以通过给药后收集各时间尿样，经测定后拟合出药物动力学参数并估算生物利用度。但其准确性受到许多因素的影响，测定结果也不如血药浓度法令人满意。然而尿药法对人体无损伤，测定人体的药动学参数比较方便，故某些情况下仍然使用。
在多数情况下，尿药浓度高于血药浓度，定量分析精密度好，测定方法较易建立，且取样方便，可免除受试者多次抽取血样的痛苦。因此，在体内药物大部分以原型从尿中排出的条件下，通常可用尿药法测定消除速度常数、生物半衰期等药动学参数。尿药法由于不适合测定药物的有关吸收动力学参数（如ka、tmax、Cmax），故无法评价相对生物利用度的速度。
本实验以静脉注射剂为参比，采用尿药数据法测定维生素B2片剂的绝对生物利用度。
三、仪器与材料
仪器：紫外-可见分光光度计，具塞试管，量筒，水浴等。
材料：维生素B2片剂（5 mg）及原料，0.02 mol/L醋酸溶液，保险粉（连二亚硫酸钠），冰醋酸等。
四、实验内容
（一）标准曲线的制备
1．配制标准储备液 先将维生素B2原料（或标准品）在105℃干燥2 h，再精密称取50 mg于500 ml量瓶中，加入0.02 mol/L醋酸溶液300 ml，于水浴上加热溶解，放冷至室温，再以0.02 mol/L醋酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得100 μg/ml的维生素B2标准储备液，密闭，置阴暗处保存。
2．制备标准曲线 精密吸取上述标准储备液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 ml分别置10 ml量瓶中，用酸化蒸馏水（取冰醋酸1 ml加蒸馏水至100 ml制得）稀释至刻度，摇匀，分别得到2、4、8、12、16、20 μg/ml的维生素B2标准样液；以酸化蒸馏水为空白，于紫外-可见分光光度计，在444 nm波长处测定标准样液吸收度（A1），然后在各瓶中加入保险粉（连二亚硫酸钠）约3 mg并摇匀，在1 min内再次测定吸收度（A2）；两次测定吸收度之差值（ΔA = A1 - A2），即为维生素B2的吸收度；以ΔA为纵坐标，C（标准样品浓度，μg/ml）为横坐标绘制标准曲线并求出标准曲线回归方程，备用。
（二）给药与取样
受试者服药前一天收集24 h尿液，量取尿液体积并记录于附表4-9，再将尿液倒入盛有0.2 ml冰醋酸的刻度试管内至20 ml，摇匀，供测定空白尿中维生素B2含量用。
临服药前排空小便，早餐后立即口服维生素B2片剂3片（5 mg/片），以温水送服，并记录服药时间。服药后，于2、4、6、8、10、12、14、16 h收集尿液，并用量筒量取各时间段尿液体积后记录于表19-10，再将尿液倒入盛有0.2 ml冰醋酸的刻度试管内至20 ml，摇匀，于阴凉避光处保存，待测。
（三）尿药浓度的测定
1．测定空白尿中维生素B2浓度 取酸化空白尿液10 ml，按“制备标准曲线”项下的方法，自“以酸化蒸馏水作空白??”起操作，测得吸收度后，以两次测定值之差（ΔA），代入标准曲线回归方程，求出空白尿中维生素B2浓度并记录于表19-9。
2．测定尿样中维生素B2浓度 分别取各时间的酸化尿液10 ml，按“制备标准曲线”项下的方法，自“以酸化蒸馏水作空白??”起操作，测得吸收度后，以两次测定值之差（ΔA），代入标准曲线回归方程，求出尿样中维生素B2浓度并记录于表19-10。
（四）注释
1．维生素B2的异咯嗪环上具有活泼的双键，能接受和放出氢原子，在保险粉（连二亚硫酸钠）的作用下，能还原为无色的产物，反应式如下：
由于维生素B2在444 nm波长处有吸收，故利用上述特征，以加入保险粉前后两次测得吸收度的差值，测出尿液中维生素B2的浓度。
2．服药前两天及在整个试验期间应控制食谱，不得吃富含维生素B2的食物，如蛋类、牛奶、奶糖等，并不得服用含B族维生素的药品。
3．每次收集尿液后，饮200 ml左右的水，以维持一定尿量。 4．在制备标准曲线以及尿药浓度测定过程中均应注意避光。
五、实验结果
（一）实验记录与数据处理
1．计算标准曲线回归方程。
2．将空白尿的测定结果记录于表19-9。并由此计算出平均每2 h空白尿中维生素B2
的排泄量。
表19-9 空白尿中维生素B2浓度 A1
A2
ΔA
24 h尿量（ml）
尿药浓度（μg/ml） 24 h总尿药量（mg）
3．将服药后尿液中维生素B2浓度测定结果记录于表19-10。并计算出平均尿药排泄速度数据，记录于表19-11。
表19-10 尿药浓度测定数据 集尿时间（h）
0～2 2～4 4～6 6～8 8～10 10～12 12～14 14～16
尿量（ml）
A1
A2
ΔA
尿药浓度（μg/ml） 维生素B2排泄量（mg）
表19-11 平均尿药排泄速度数据表 集尿时间（h）
0～2 2～4 4～6 6～8 8～10 10～12 12～14 14～16
（h）
（h）
（mg）*
（mg/h）
*ΔXu = 维生素B2排泄量 -相同时间间隔内空白尿中维生素B2排泄量（派头空二格）
（二）药物动力学参数与绝对生物利用度的求算
1．本实验所测尿药数据按“尿药排泄速度法”拟合药动学参数（按单室模型拟合，具体方法详见第八章），首先作
～
图。
2．由上述曲线末段直线段尿药数据，求回归直线方程，并由斜率计算出消除速度常数（k）及生物半衰期（t1/2）。
3．计算口服给药后尿液中维生素B2的总排泄量（量替代。
）；可近似由16 h内总排药
4．按文献资料，人体静注维生素B2后尿中总排泄量约为给药剂量的97%，由此估算口
服维生素B2片剂的绝对生物利用度（F），
5．将上述所求参数及绝对生物利用度记录于表19-12。
表19-12 维生素B2的药动学参数与绝对生物利用度
k（h-1）
t1/2（h）
（mg）
。
F（%）