(c)用凝胶电泳分离DNA片段 (d)DNA片段转移至硝酸纤维素膜上
(e)用一个标记的探针与膜杂交 54． 报告基因( )
(a)以其易于分析的编码序列代替感兴趣基因的编码序列
(b)以其易于分析的启动子区代替感兴趣基因的启动子区
(c)能用于检测启动子的活性 (d)能用于确定启动子何时何处有活性
55． 在利用lacZ失活的显色反应筛选法中，IPTG的作用是( )
(a)诱导宿主的α肽的合成 (b)诱导宿主的ω肽的合成
(c)作为酶的作用底物 (d)作为显色反应的指示剂
56. 切口移位是指在( )作用下，使( )带上放射性标记。
(a)DNA聚合酶I，RNA (b)DNA聚合酶I，DNA (c)DNA聚合酶Ⅲ，RNA (d)DNA聚合酶Ⅲ，DNA 57．用于核酸分子杂交的探针可以是放射性标记的( ) (a)DNA (b)RNA (c)抗体 (d)抗原 58．Southern印迹是用DNA探针检测DNA片段，而Northern印迹则是：( )
(a)用RNA探针检测DNA片段 (b)用RNA探针检测RNA片段
(c)用DNA探针检测RNA片段 (d)用DNA探针检测蛋白质片段
59．用免疫化学法筛选重组体的原理是( )
(a)根据外源基因的表达 (b)根据载体基因的表达
(c)根据mRNA同DNA的杂交 (d)根据DNA同DNA的杂交
60．随机引物标记探针，下列各项中哪一项是不正确的?( )
(a)双链DNA、单链DNA、RNA都是可以标记的 (b)不需要用Dnase I预处理
(c)反应时可用Klenow酶 (d)反应时可用DNA聚合酶1
61．在切口移位标记DNA探针时只能使用( )
(a)Klenow酶 (b)DNA聚合酶I (c)DNA聚合酶Ⅱ (d)DNA聚合酶Ⅲ
62．要对一双链的DNA分子进行31末端标记，可用( )
(a)Klenow酶 (b)DNA聚合酶I (c)T4DNA聚合酶 (d)T7DNA聚合酶
答案
1．c；2．c； 3．b； 4．b 5．b，C，d，e； 6．c； 7．b； 8．d；9．d； 10．B； 11．d； 12．a； 13．d； 14．b 15．d； 16．c；17．a，b；18．a；19．c；20．d；21．c；22．C； 23．b； 24．C；25．d；26．a，C，d；27．b；28．c； 29．b；30．a；31．c； 32．a,c,d,e， 33．a，b，c；34．b； 35．c；36．c； 37．d； 38．b；39．c；40．a；41．c； 42．a，b，c； 43．b； 44．b； 45．d； 46．a；47．a； 48．c； 49．c；50．b；51．c； 52．c； 53．b； 54．a,c,d；55．a； 56．b；57．a，b； 58．c；59．a；60．d；61．b； 62．c；
三、简答题
1．说明Sanger DNA测序法的原理。
Sanger DNA测序法是建立在两个基本原理之上：(1)核酸是依赖于模板在聚合酶的 作用下由5'端向3'端聚合(DNA聚合酶参与了细菌修复DNA合成过程)；(2)可延 伸的引物必须能提供游离的3'羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的3'羟基末 端，因此会终止聚合反应的进行。如果分别用4种双脱氧核苷酸终止反应，则会获 得4组长度不同的DNA片段。通过比较所有DNA片段的长度可以得知核苷酸的 序列。
2．某学生在用EcoRI切割外源DNA片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因? 盐离子浓度不对，温度不对，甘油浓度过高。
3．在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一个6bp的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么? 回文序列是：5'-CATATG-3，
4．下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是Ⅱ类酶的识别序列：
GAATCG，AAATTT， GATATC， ACGGCA? 为什么? GATATC；AAATTT，因为它们是回文序列。
5．当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施?
为什么?
注意星活性，先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一 种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星活性。或使用通用缓冲液。 6． 为什么反转录酶在聚合反应中会出错?
由于反转录酶缺少在E．coli DNA聚合酶中起校正作用的3'-5'外切核酸酶活性，所以聚
合反应往往会出错，在高浓度的dNTP和Mg2+下，每500个碱基中可能有一个错配。 7． 什么是测序酶(sequenaseTM)?
所谓测序酶即是修饰了的T7 DNA聚合酶，是采用缺失的方法，从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸，这样使T7 DNA聚合酶完全失去了3'-5'的外切核酸酶活性，只有5'---3'聚合酶的活性，而且聚合能力提高了3～9倍，测序时常用此酶。 8． 什么是S1核酸酶作图(S1 nuclease mapping)?
S1核酸酶作图是一种对RNA转录产物的末端和剪接位点进行作图的方法
9 YAC载体具有什么样的功能性DNA序列?为什么在克隆大片段时，YAC具有优越 性?
YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA复制起点，两个端粒。YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。
10． 列举质粒载体必须具备的4个基本特性。
(1)独立复制； (2)有选择标记； (3)有独特的酶切位点； (4)能转化但不扩散。 11． 什么叫穿梭载体？
含有细菌质粒和克隆的真核生物DNA片段的杂种质粒，有两个复制起点和既能在细菌又能在真核细胞中进行选择的选择标记，所以，很容易从一宿主转到另一个宿主(来回穿梭)。
12． 如何将野生型的?噬菌体改造成为一个理想的载体?
(1)削减分子量(除去非必需区和整合区)； (2)削减酶切位点； (3)添加选择标记； (4)引入终止突变
13． PCR的基本原理是什么?用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息? (1)DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。 (2)至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。 14． cDNA克隆与基因组克隆有何不同?
基因组克隆包含所有不在cDNA中出现的内含子。
15． 怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoR I限制位点中去?
化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中
16． 简述以黏粒为载体构建基因文库的原理。
(1)COS位点可以自身环化； (2)可以利用COS位点包装?噬菌体颗粒； (3)可以感染寄主细胞； (4)利用质粒复制子复制，不整合、不裂解。 17． 酵母人工染色体要在酵母细胞中稳定存在，必须有哪些基本的结构? (1)着丝粒； (2)端粒； (3)ARS序列。 18． 何谓YAC? 主要特性是什么?
(1)含有来自其他生物DNA的酵母人工染色体，叫YAC； (2)主要特性是可以克隆较大的外源片段。
19． Muller的PCR反应同大肠杆菌体内的DNA复制有哪些不同?你认为根本的差别在 哪里?
PCR用双引物，体内复制用单引物。
20．欲将一真核生物的结构基因克隆后转移到原核生物(如E．coli)中进行表达，克隆时应
注意哪些问题?
应注意的问题有：启动子、密码子、剪接、分泌。
21．假定你分离到一个E．coli的Thy- 突变体，并推测有可能是ThyA基因突变。请设计 一个方案用PCR从染色体DNA扩增突变的ThyA基因，测定突变的序列。(注：E．coli
野生型的ThyA基因的序列是已知的) 为了扩增突变体的thyA基因，先设计一对引物，其中一个引物的序列与thyA基因的5’端相同，另一个引物同该基因的3’端互补。在引物的5’端加上合适Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，以便于后来的克隆。将染色体DNA同引物混合后，进行PCR扩增。然后进
行琼脂糖凝胶电泳，纯化扩增片段，可以直接测序或克隆到合适的载体再测序。
22． 你在做Southern印迹分析，并且刚完成了凝胶电泳这一步。根据方案，下面一步骤 是用NaOH溶液浸泡凝胶，使DNA变性为单链。为了节省时间，你略过了这一步， 直接将DNA从凝胶转至硝酸纤维素膜上。然后用标记探针杂交，最后发现放射自
显影片是空白。错在哪里?
如果你的杂交探针是双链的，可能因为在加人杂交混合物之前忘记将探针变性而得到空白的放射自显影结果。
23．切口移位(nick translation)标记探针的主要步骤有哪些? (1)DNaseI造成切口；
(2)DNA聚合酶III的5’ ?3’外切核酸酶进行切割； (3)DNA聚合酶Ⅲ的5’?3’合成酶进行修补；
(4)在修补过程中，随着切口(nick)的移动，将放射性的底物掺人到双链DNA中。 24．用EcoRI和Hind Ⅲ分别切割同一来源的染色体DNA，并进行克隆，在前者的克隆
中筛选到A基因，但在后者的克隆中未筛选到A基因，请说明原因。 原因是：HindⅢ的切点在A基因内。
25．什么是Western印迹?它与Southern印迹有什么不同?
Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与Southern的不同在于探针的性质不同，在Western印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。
26．用一限制性内切核酸酶切割Lac+ Tet+的质粒载体，已知该酶识别的是4个碱基序列， 并产生有两个碱基突出的单链末端，该酶在lac基因内有切割位点，并在第二个氨基
酸密码子内，该位点可以被任何氨基酸所取代而不影响酶活性。用该酶切割后，用
DNA聚合酶将单链末端补齐为双链的平末端，然后重新连接成环，转化Lac- Tets 受体菌，筛选Tetr转化子，问：Lac的基因型是什么?并说明原因。
基因型是lac-．原因是在该密码子中插入了两个碱基，造成了移码突变，所以Lac的基因是缺陷的。
27．在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA
而不用基因组DNA?为什么要在cDNA前加上细菌的启动子?
这是因为细菌没有内含子剪接系统，并且不能识别真核生物的启动子之故。
四、问答题：
1． 说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。
2． 什么是限制性内切核酸酶的星号活性? 受哪些因素影向?
3． 影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些?
4． 什么是Klenow酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?
5．细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途?
6．λ外切核酸酶(1ambda exonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么应用?
7．Mn2+、Mg2+对Dnase I(deoxyribonuclease ?)的活性有什
么影响?Dnase I在基因工程中有什么作用? 8．质粒如何维持在细胞中的稳定？