2.方案二：急性酒精性肝损伤模型 2.1 原理
机体大量摄入乙醇后，在乙醇脱氢酶的催化下大量脱氢氧化，使三羧酸循环和脂肪酸氧化减弱而影响脂肪代谢。乙醇通过增加甘油三酯合成，减少脂肪氧化，降低肝脏运出脂肪的功能，增加脂肪组织的脂肪动员,引起早期酒精性脂肪肝和高脂血症。 2.2 实验动物
成年大鼠或小鼠，单一性别，大鼠（180-220克），每组8-12只；小鼠（18－22克），每组10-15只。 2.3 实验方法 2.3.1 剂量和分组
至少设三个剂量组，同时设阴性对照组和模型对照组，必要时设溶剂对照组。以人体推荐量的10倍(小鼠)或5倍(大鼠)为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，最高剂量不得超过人体推荐量（以公斤计算）的30倍。用无水乙醇（分析纯）造成肝损伤模型，无水乙醇浓度为50％（以纯净水稀释），灌胃量12ml～14ml/kgBW（乙醇密度0.8g/ml，折合乙醇的剂量为4800～5600mg/kgBW）。 2.3.2 给予受试样品的途径和时间
经口灌胃给予受试样品，无法灌胃时将受试样品掺入饲料或饮水亦可，并记录每只动物的饲料摄入量或饮水量。原则上连续给予30天. 2.3.3 实验步骤和造模方法
每日经口灌胃给予受试样品，阴性对照组和模型对照组给予纯净水。将动物每周称重两次，按体重调整受试样品量。模型对照组和各样品组于实验结束时一次灌胃给予50%的乙醇，小鼠灌胃量12ml/kg BW，阴性对照组给予纯净水，禁食16h。动物腹腔注射60mg/kg BW的戊巴比妥钠溶液麻醉后腹主动脉采血，并取肝组织，进行各项指标的检测及病理组织学检查。
2.3.4 检测指标
体重 、血清中甘油三酯（TG）、血清中极低密度脂蛋白(VLDL)、肝组织病理学检查(肝细胞脂肪变性)。
2.4 血清中甘油三酯（TG）测定 2.4.1测定方法
推荐采用酶法（GPO-PAP法）。采用用全自动或半自动生化仪测定血清中TG的含量。 2.4.2 数据处理
数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值＞F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
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2.4.3 结果判定
模型对照组与阴性对照组比较TG含量升高有统计学意义（P＜0.05），表示模型成立。在模型成立的前提下，受试样品组TG含量与模型对照组比较降低，差异有显著性（P＜0.05），判定该指标结果阳性。
2.5 血清中极低密度脂蛋白（VLDL）测定 2.5.1 测定方法
推荐采用ELISA法。采用极低密度脂蛋白ELISA试剂盒测定血清中的VLDL的含量。 2.5.2 数据处理 2.5.3 数据处理
数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值＞F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。 2.5.4 结果判定
模型对照组与阴性对照组比较，血清VLDL含量升高有统计学意义（P＜0.05），表示模型成立。在模型成立的前提下，受试样品组血清VLDL含量与模型对照组比较降低，差异有显著性（P＜0.05），判定该指标结果阳性。 2.6 肝脏病理组织学变化、诊断标准和结果判定 2.6.1 实验材料
从小鼠肝左叶中部做横切面取材，冰冻切片，苏丹Ⅲ染色。 2.6.2镜检
从肝脏的一端视野开始记录细胞的病理变化，用5倍物镜连续观察整张组织切片。主要观察脂滴在肝脏的分布范围和面积。 2.6.3评分标准 肝细胞内脂滴无或稀少。 含脂滴的肝细胞不超过1/4 含脂滴的肝细胞不超过1/2 含脂滴的肝细胞不超过3/4 肝组织几乎被脂滴代替 2.6.4 数据处理
采用方差分析或秩和检验。方差分析需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值＞F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。 2.6.5 结果判定
模型对照组与阴性对照组比较脂肪变性程度加重有统计学意义（P＜0.05），表示模型成立。在模型成立的前提下，受试样品任何一个剂量组与模型对照组比较，脂肪变性程度减轻，有
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0分 1分 2分 3分 4分 统计学意义（P＜0.05），可判断为阳性结果。 2.7 急性酒精性肝损伤的结果判断
在模型成立的前提下，血清中TG、VLDL两项指标阳性和病理组织学检查结果阳性，可判定受试样品对急性酒精性肝损伤有辅助保护功能。
3 方案三：亚急性酒精性肝损伤模型 3.1 原理
机体反复多次过量摄入乙醇后，乙醇可通过诱导CYP4502E1，引起氧化应激、脂质过氧化、代谢/营养的紊乱以及线粒体结构和功能的改变等一系列反应，导致肝细胞的功能损伤，进而引起肝组织中甘油三酯含量聚积，胆固醇合成加强，并引起相应载脂蛋白含量的改变。 3.2 实验动物
成年大鼠或小鼠，单一性别，大鼠（180-220克），每组8-12只；小鼠（18－22克），每组10-15只。 3.3 实验方法 3.3.1 剂量和分组
至少设三个剂量组，同时设阴性对照组和模型对照组，必要时设溶剂对照组。以人体推荐量的10倍(小鼠)或5倍(大鼠)为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，最高剂量不得超过人体推荐量（以公斤计算）的30倍。 3.3.2受试样品的给予
经口灌胃给予受试样品，无法灌胃时将受试样品掺入饲料或饮水亦可，并记录每只动物的饲料摄入量或饮水量。原则上连续给予30天，必要时可延长至45天。 3.3.3 实验步骤 3.3.3.1造模方法
每日经口灌胃给予受试样品，阴性对照组和模型对照组给予纯净水。将动物每周称重两次，以调整受试样品剂量。模型组和样品组于实验结束前14天每天经口灌胃给予30%的乙醇，小鼠灌胃量10ml/kg BW（乙醇密度0.8g/ml，折合乙醇的剂量为2400mg/kgBW）。样品灌胃后间隔4小时以上再给予乙醇。实验结束前禁食4h，经腹腔注射60mg/kg BW的戊巴比妥钠溶液麻醉后，腹主动脉采血，并取肝组织，进行各项指标的检测及病理组织学检查。 3.3.3.2 血清生化指标检测
体重、血清中胆固醇（CHOL）、血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、血清中胆红素（TBIL）、肝组织病理学检查。 3.4 CHOL、LDL和TBIL测定 3.4.1测定方法
血清胆固醇（CHOL）推荐采用酶法（COD-PAP法），血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL)推荐采用匀相测定法，血清胆红素（TBIL）推荐采用改良J-G法。血样离心（2500rpm）后取上清，上全自动或半自动生化仪测定血清中CHOL、LDL和TBIL的含量。
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3.4.2 数据处理
数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验。方差齐，计算F值，F值< F0.05，各组均数间差异无显著性；F值>F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。 3.4.3 结果判定
模型对照组与阴性对照组比较，血清CHOL、LDL和TBIL含量升高有统计学意义（P<0.05），表示模型成立。在模型成立的前提下，受试样品组血清CHOL、LDL和TBIL含量与模型对照组比较降低，差异有显著性（P<0.05），判定该指标结果阳性。 3.5 肝脏病理组织学变化、诊断标准和结果判定 3.5.1 实验材料
取小鼠肝脏左叶用10%福尔马林固定，从肝左叶中部做横切面取材，常规制片，HE染色。 3.5.2 镜检
用5倍物镜连续观察整张组织切片，主要观察肝细胞变性（脂肪变性、水样变性、胞浆凝聚、气球样变）、肝细胞坏死和炎症改变等，并同时给予记录。2.5.3 评分标准
肝细胞气球样变：
无肝细胞气球样变 偶见肝细胞气球样变 气球样变的肝细胞占整个视野的1/3以内 气球样变的肝细胞占整个视野的1/3以上 肝细胞广泛的气球样变 肝细胞脂肪变性： 无肝细胞脂肪变性 偶见肝细胞脂肪变性 灶状肝细胞脂肪变性，占肝细胞总数1/3以内 脂肪变性肝细胞占1/3以上 肝细胞弥漫脂变 胞浆凝聚： 未见肝细胞胞浆凝聚 偶见肝细胞胞浆凝聚 胞浆凝聚的肝细胞占整个视野的1/3以内 胞浆凝聚的肝细胞占整个视野的1/3以上 肝细胞广泛的胞浆凝聚 水样变性： 未见水样变性的肝细胞 0级 0分 0级 0分 I级 1分 II级 2分 III级 3分 IV级 4分 0级 0分 I级 1分 II级 2分 III级 3分 IV级 4分 0级 0分 I级 1分 II级 2分 III级 3分 IV级 4分 - 8 -