3. 功能缺失型突变与功能获得性突变及特点
答：（1）功能缺失型突变：是由于突变导致基因功能的丧失或减弱。如果由于DNA序列的插入、丢失或重要的碱
基替换造成的蛋白质功能的完全丧失，或导致转录产物的提前终止，使得基因功能完全丧失。则称为零突变或剔除突变。如果基因突变仅造成基因表达水平或基因产物活性的降低，这种突变称为亚效突变或渗漏突变。如果这个基因的突变导致表型变异，那么零突变表型变异应该是完全、彻底的，而亚效突变的表型取决于基因表达水平或基因产物活性降低的程度，介于零突变和野生型之间。功能缺失型突变一般为隐性突变。
（2）功能获得型突变：是从本质上改变基因作用的一种突变，它可以在个体
的特定组织、细胞或特定时间使得原来不表达的基因得以表达，或表达较弱的基因表达水平得以提高。一 般是显性突变。如果基因表达的空间方式被改变，即基因表达产物在基因原来不表达的的部位积累的，这 种表达方式称为异位表达。基因的异位表达经常出现超出预期的表型变化。
（3）如果一个基因在个体基因组中具有多个拷贝，功能缺失型突变一般不造成明显的表型变异，因为突变拷贝 功能会被其他正常的拷贝所弥补。而功能获得型拷贝则可以使基因原来的功能相互叠加，表型更加明显。
三，论述（大概）（任选两题，每题15分）
1. 用所学分子遗传学知识论述怎么确定基因的功能
答：在功能基因组学的研究中通常运用高通量技术，如DNA微阵列，反向遗传学技术如基因打靶，转基因以及反
义mRNA和RNA干扰等技术来系统地分析基因功能及基因间相互作用，基因组的时空表达以及发现和寻找新基因等。
1、DNA微阵列技术又称DNA芯片或基因芯片技术，它通过将对应于不同基因 或cDNA的DNA片段或寡聚核苷酸点样于微芯片上形成高密度的矩阵，与荧光标记的总mRNA进行杂交，然后通过激光共聚焦扫描检测并运用计算机软件对杂交信号进行自动化定性定量分析，具有高通量、实时、灵敏、准确等特点。 2、基因打靶是指通过转染的DNA序列与细胞内同源的基因组序列（靶序列）之间进行同源重组，以改变靶序列来研究其结构和功能或进行基因治疗的技术。基因打靶技术包括基因敲除和基因敲入，前者是用无功能的DNA序列与靶序列重组，破坏原基因组的遗传功能，后者是用有功能的DNA序列与受到破坏的靶序列重组使其恢复遗传功能。基因打靶技术是一种从基因到表型的新研究方法，属于反求遗传学范畴。 3、反义mRNA技术通过向细胞导入一段与特定编码mRNA互补的非编码RNA链，使其与该段mRNA特异性结合而定向阻抑靶基因表达的技术。这一技术的成熟，为功能基因组学的研究和基因治疗提供了新的思路。在反义mRNA技术的研究过程中，科学家们意外发现导入正义mRNA与导入反义mRNA具有等效的阻抑效应。而更令人吃惊的是如果导入相应双链RNA（dsRNA），其阻抑效应比导入任一单链RNA强十倍以上，dsRNA若经纯化则阻抑效应更强。这种双链RNA特异性地作用于与其序列配对的基因而抑制其表达的现象叫做RNA干涉。RNA干涉技术作为一种新的定点敲除knockdown技术，赋与了功能基因组学、基因治疗等全新的思路，堪称生命科学近年来的革命性的突破。因而发现RNA干扰机制的两位美国科学家Fire和Mello荣获2006年诺贝尔生理学或医学奖(表1－1)。可见该项成果的重大科学意义。
2. 突变体在克隆及基因功能中的应用
答：突变体是遗传学研究的重要材料，其表型与基因型是基因功能研究的直接证据，因此突变体的创制和特异突变
体的筛选非常重要。已知突变体可分为自发突变和人工诱变。自发突变不足以满足现代遗传学研究的需要。诱发突变则可以利用人工的方法提高基因突变频率，在短时间内创制大量突变体，还可以获得许多在自发突变下很难产生的新类型突变体。基因诱变常用的化学诱变因素多为烷化剂，如EMS和N-甲基-N-亚硝基脲等，物理诱变因素为电离辐射和快种子等，生物诱变因素为转座子、逆转座子等。
1、EMS突变体：EMS处理生物材料可使DNA的鸟嘌呤第六位酮基烷化而形成O6-乙基鸟嘌呤，而O6-乙基鸟
嘌呤可以与腺嘌呤配对而不能与胞嘧啶配对。因此，原来DNA中的G-C对通过随后的修复变为A-T。通常EMS诱发突变99%为C/T突变，导致C/G变为T/A碱基替换。因此，我们不仅仅可以通过EMS造成转录提前终止的功能突变体来研究基因的功能，也可以通过通过错义突变引起的一些表型较弱，中间类型的突变体来研究功能蛋白中某个特定氨基酸残基的功能。
2、快中子突变体：电离辐射是原子核发生衰变时所放出的射线，种类很多，主要有：α射线，β射线，γ射线，n射线，快中子具有能量高、辐射处理的剂量容易控制和操作简便等特点，在生物诱变上具有独到的优点；诱变的剂量容易控制，在一个基因组上可以存在多个突变位点，同时诱变后生物材料仍保持较高的活性，诱变后的材料可以不经任何处理直接进行筛选。
3、T-DNA标签突变体：T-DNA标签技术是以农杆菌介导的遗传转化为基础的一种插入突变研究方法。由于农杆菌的寄主范围较广,转化技术成熟,故是创造插入突变体的有效途径。而T-DNA插入植物基因组后悔破坏原有基因的表达模式导致突变体的产生，同时又可作为标签用来克隆功能基因。
4、转座子标签突变体：由于转座子活跃的转座活性能导致高频率的基因突变而被广泛应用与病毒、细菌、酵母、
果蝇、拟南芥菜、水稻等物种的突变体创制与基因功能研究。
3. 试用两种方法扩增特定位点两侧序列
2010中国农科院分子遗传学 一、名词解释
1、朊病毒：2012 2、RNA编辑：2012
3、信号肽：常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的N-末端的氨基酸序列（有时不一定在N端）。 4、宏基因组学（metagenome）：即生境中全部微小生物遗传物质的总和，目前指环境样品中的细菌和真菌的基因组
总和。
5、显性负突变：（dominant negative mutation）：突变基因的产物与原来正常基因的产物相拮抗的一种突变。它是由
于氨基酸的替换或缺失造成多肽构象的改变，当这个突变多肽与野生型亚基以多聚体形式存在，它降低和破坏了多聚体的活性。
6、miRNA：2011
二、简答：
1、DNA甲基化对基因转录控制
答：⑴ 直接干扰特异转录因子与各自启动子结合的识别位置 DNA的大沟是许多蛋白因子与DNA结合的部位，
胞嘧啶的甲基化干扰转录因子与DNA的结合。许多转录因子，如AP-2和E2F等能识别含CpG的序列，且对其甲基化程度非常敏感，当CpG上的C被甲基化后，转录即被抑制
⑵ 转录抑制复合物干扰基因转录 甲基化DNA结合蛋白与启动子区内的甲基化CpG岛结合，再与其它一些蛋白共同形成转录抑制复合物，阻止转录因子与启动子区靶序列的结合，从而影响基因的转录。已经鉴定了甲基化胞嘧啶结合蛋白1和2(MeCP1和MeCP2)及甲基化DNA结合蛋白（MBD）等转录抑制复合物。 ⑶ 通过改变染色质结构而抑制基因表达 DNA甲基化与组蛋白去乙酰化正相关，而乙酰化修饰正是调节基因表达的另一重要方式。染色质构型的变化伴随着组氨酸的乙酰化和去乙酰化，许多乙酰化和去乙酰化酶本身就分别是转录增强子蛋白和转录阻遏物蛋白。DNA失活的区域处于高度甲基化状态，同时又富含低乙酰化组氨酸。CpG二聚体中胞嘧啶甲基化是高等真核生物基因组的主要特征。一般来说，在基因启动子区的DNA甲基化伴随着基因沉默
2、端粒及端粒酶作用
答：（1）端粒是线状染色体末端的DNA重复序列，是真核染色体两臂末端由特定的DNA重复序列构成的结构，
使正常染色体端部间不发生融合，保证每条染色体的完整性。端粒是短的多重复的非转录序列及一些结合蛋白组成特殊结构。一个基因组内的所有端粒都是由相同的重复序列组成，但不同物种的端粒的重复序列是不同的。端粒的作用为：
1稳定染色体末端结构，防止染色体间末端连接，并可补偿滞后链5'末端在消除RNA引物后造成的空组织 ○
培养的细胞证明，端粒在决定动植物细胞的寿命中起着重要作用，经过多代培养的老化
2 细胞端粒变短，染色体也变得不稳定。 ○
3 染色体由于融合、降解、重排而形成不稳定结构从而威胁到DNA的正确复制和细胞生存，端粒的存 ○
在能够保护染色体免于化学修饰、被核酸降解以及因端端作用而产生的威胁。
4 端粒使染色体末端区域形成异染色质，在细胞进行减数分裂的过程中结合到核膜一特定区域，使得染色○
体寻找同源染色体启动和配对的过程更加容易，并且保证了染色体分离的正确性[10~13]。
5在细胞有丝分裂的过程中，○端粒会随着分裂次数的增加逐渐缩短，当端粒缩短到一定程度时便无法继续维
持染色体的稳定，细胞最终死亡，故而能够根据端粒的长度预测细胞的寿命。但是在生殖细胞中，端粒的长度不随细胞分裂而缩短，推测是由于生殖细胞中富含端粒酶的缘故。
（2）端粒酶：一种与染色体3’突出端相结合的核蛋白，具有反转录活性，其模板就是本身含有的核糖核酸分
子。该分子含有1.5倍拷贝的完整端粒序列，可与端粒3’端DNA互补，反转录酶活性被激活并以其RNA为 模板合成互补DNA的3个核苷酸，然后RNA模板与DNA产物解离，再次与端粒上最后3个核苷酸互补，反转录合成端粒重复序列，并重复此过程是3’端延长。
1 5’端的延伸机制：由于3’端的延伸为5’端的复制提供了额外的模板，引物合成酶合成引物后，再由DNA ○
聚合酶III使5’端也得以延长，但引物去除后，其3’端仍有一段单链区，这种机制的作用就是使染色体的末端不会因为复制而变得越来越短以致删除染色体末端重要的基因，保持细胞持续的分裂能力。
2 染色体末端保持适当长度的机制： ○与端粒区双链结合的蛋白仍能控制端粒的长度，它们具有弱的抑制端粒
酶的活性，但具有几个端粒重复序列时，这些蛋白无抑制活性，并不与端粒酶结合，而端粒酶的反转录活性被激活，但随着端粒变长，这些蛋白质积聚并抑制端粒酶活性，使染色体末端保持适当的长度。
2、突变的分子基础及诱导突变的因素 答：一、基因突变的分子机制
1、碱基替换：异构体中原子的位置及原子之间的键，在DNA复制过程中发生碱基错配，造成碱基替换突变。 2、插入或缺失突变：较大一段DNA序列的插入或缺失引起的突变。
3、移码突变：是由于DNA核苷酸移位造成的氨基酸编码的改变，通常是由碱基插入、 丢失所造成的一种突变现象。如果碱基插入或丢失的不是3个或3的倍数，则DNA编码的氨基酸序列发生了改变从而导致功能的突变，甚至造成翻译产物的提前终止，对表型的影响也很大。如果碱基插入或丢失的是3个或3的倍数而且数目较少时，则在翻译产物中增加或丢失了一个或少数几个氨基酸，而且这样的氨基酸残基对蛋白质的功能不太重要，这样的突变对表型的影响不大。如果是重要的氨基酸残基则严重影响基因产物的功能，对表型影响也最严重，甚至致死。 二、诱发基因突变的因素 1、基因突变的生物因素
（1）DNA转座：是由转座子介导的遗传物质的重排现象，可引起插入突变，产生新的基因和染色体畸变。 （2）转基因：是通过生物、物理或化学的方法将DNA片段或基因转移、插入并整合到目的基因组中，是诱发
基因突变的有效途径。
（3）敲除突变：DNA插入转录区内或紧邻转录起始位点的部位或插入转录调控区或内含子中能够有效的破坏
靶基因的表达，这种突变就称之为
（4）削减突变：DNA的插入仅仅降低了靶基因的表达，这种突变叫做 2 、基因突变的物理及化学因素
（1）紫外线：○1 UV可以诱导胞嘧啶水解形成羟胞嘧啶而导致下次复制过程中碱基错配；○2 UV诱导同一条
DNA链上两个相邻的嘧啶形成嘧啶二聚体，主要是胸腺嘧啶二聚体，造成双螺旋结构的扭曲；○3胸腺嘧啶二聚体也可以发生在两个单链之间，形成稳定的二聚体，因而阻断了DNA的转录和复制。○4紫外线可以引起各种形式的颠换、转换、缺失、重复和移码突变。
（2） 电离辐射：波长比紫外线短的射线以及由放射性元素激发的电离辐射在穿透组织的途径中与水或活组织
作用，产生高活性的自由基。自由基与DNA等其他分子反应，就会产生癌变或其他突变。离子辐射引起的突变频率随着剂量的增加而提高，突变通常造成DNA单链断裂、双链断裂、碱基组成改变以及真核生物中的染色体断裂等遗传学效应。
（3）碱基的氧化损伤：活性氧对DNA产生氧化损伤，也可对其前体造成氧化损伤而诱发突变。这种突变与人
类的多种疾病有关。
（4）碱基类似物与碱基替换：碱基类似物是结构与DNA 4个碱基非常相似的化合物，在DNA正常复制过程中
可以代替正常的碱基而掺入DNA的双链，由于它比正常的碱基更易于发生错配而引起基因的突变。如5-溴尿嘧啶、5-溴脱氧尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、2-氨基嘌呤，等，他们可使DNA子链中产生A-T向C-G的转