溶菌酶1

5~6范围比较稳定,p H大于 7活性急剧下降,且该溶菌酶p H 6左右时最稳定,在 p H 5.3-6.9范围内相对稳定。初步说明该溶菌酶在偏酸性环境下比较稳定。这与大部分文献报道基本一致。这也为将溶菌酶制成 p H 5 ~7的液体制剂提供了依据。【7】

(2)最适温度: 方法:蛋清溶菌酶最适作用温度的测定:在pH值6.2的相同磷酸盐缓冲液中,分别在不同温度下测定溶菌酶酶活性。

(3)热稳定性:

溶菌酶作用的最是温度在35-50摄氏度,最是温度37摄氏度,适宜PH5.3-7.4,最适PH6.8,水溶液在3-11之间是稳定的。具有较强的热稳定性,在PH4-8时,100摄氏度的条件下处理1分钟酶仍保持90%以上。【6】

四:提取原材料和提取方法:

溶菌酶广泛存在于家禽的蛋清、哺乳动物组织的分泌液中,一些植物(如卷心菜、木瓜等)的汁液中也有强力的溶菌酶活性。目前一般从蛋清和蛋壳中提取溶菌酶。

提取原料:鸡蛋(含量约为2%到4%)。鸡蛋清按水分和固形物所占比重,则含水分87%,固形物13%;固形物中大约90%是蛋白质。 【15】

提取方法:

①蛋清中溶茵酶的提取:蛋清中的溶菌酶可用吸附法提取,过程如下:蛋清过滤(90目 100目),加入724型树脂吸附(每 公斤蛋清加15g)一倾去蛋清一冲洗并控干树脂。用质量分数10%硫酸铵洗脱一洗胶液中加入晶体硫酸铵(30g/100mL)沉淀溶菌酶,沉淀晾干即得到溶菌酶粗制品。 蛋清中的溶菌酶也可用直接结晶法制取,即在蛋清中加入食盐(NaCI)。使其质量分数达到5%,并调节溶液pH值至10.0左右,加入少许溶菌酶晶体为晶种,于-4摄氏度冰箱冷却静置7d一14d即可获得溶菌酶的结晶品。这种工艺方法可获得较高纯度的溶菌酶,收率也比较高。可广泛用于从蛋清提取溶菌 酶的工业化生产。

②蛋壳中溶茵酶的提取:蛋壳中(实际上是蛋壳膜)溶菌酶含量虽然较低,但从变废为宝的角度考虑,仍是提取溶菌酶的重要原料。具体工艺流程如下:蛋壳一质量分数1%NaCI抽提滤液加热去除杂蛋白,加聚丙酸凝聚(富集),溶解凝聚物,加氯化钙沉淀上清液结晶。

③菜心叶子高速捣碎后,滤液经酸碱处理,硫酸铵分步沉淀,凝胶柱层析等步骤分离纯化溶菌酶,酶比活力达3414.6U/mg,纯化倍数为197.4。菜心溶菌酶在较宽的温度或pH值范围均有活性,最适温度为60℃,最适pH值为5.8,底物Km值为87μg/mL。该酶对热和酸碱的稳定性较高,巯基和酪氨酸残基不是该酶活性中心的必需基团。【11】

④从海参肠中分离纯化溶菌酶,并测定其酶学性质及抑菌作用。在4℃下将海参肠打浆,用Tris2HCl缓冲液抽提。上清液经浊点萃取法(CPE)浓缩、阳离子交换柱(CM52纤维素)层析和SephadexG275凝胶过滤层析分步纯化,得到电泳纯的溶菌酶。该酶的比活力达到3026.1U/mg,纯化倍数为18.7,活力回收为46.0%。对纯化的溶菌酶性质研究表明,该酶相对分子质量约为16000,对溶壁微球菌的最适作用温度为35℃,最适作用pH6.5,在45℃以下和pH4.0~8.0都有较好的稳定性,并与常见金属离子和化学试剂有良好的配伍性。与通常从蛋清中提取的溶菌酶相比较,从海参中分离纯化的溶菌酶具有广谱杀菌功能,即对常见的革兰氏阴性菌和阳性菌细胞壁均有溶解作用。【12】

五:溶菌酶的提取,分离,纯化:(重点):

工业上多采用直接结晶法,亲和色谱法,离子交换法,超滤与亲和色谱连用法等生产溶菌酶。根据Vaidya报道,采用N-异聚丙烯酰胺与酸性单体的共聚体从蛋清中热沉淀溶菌酶,得到90%的收率。【9】

①结晶法:

结晶法是一种传统的制备溶菌酶的方法,通过改变溶液条件,使溶菌酶以结晶态析出。以王敏的制备卵清溶菌酶实验方法为例,介绍结晶法制备溶菌酶: 结晶法分离溶菌酶的产率一般为60%~80% 。

这种方法操作简单,应用于卵清溶菌酶结晶品的工业生产,使产品的成本大大降低,为其医药应用作出了贡献。但是其生产周期较长,产率

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