ｔ。，；Ｙ：９７７７３５々’娄号：Ｑ翌４±．毋一ＵＤ譬竣代俨ｌ０７１２研究生学号：Ｓ０３２８６ｃ：—』二Ｌ岔丌■ｉ注密级能级：⑧：，毒北参椽餐戡大学２０＂０６届攻读硕士学位研究生学位（毕业）论文青鳊鱼鳃内Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ基因的克隆及皮质：醇对其表达的影响一。’一０‘’’；。：ｊ‘’ｊ，。｜’’ｔ研究氪ｊ向ｉ；娑建匿壁枣基罂研究学科ｊ’专业氆．筮重＿生物堂．一一牛：ｉ堡鏖些数援指导教师ｔ：堕毖匝完成忖．间：２Ｃ０６．６中囡陕西枥凌中文摘要１青鲔鱼鳃内Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ基因的克隆及皮质醇对其表达的影响摘要皮质醇作为环境污染物，有关其生态危害性的研究未见报道。由于血清皮质醇的正常变化对鱼类洄游过程中的渗透压平衡调节起至关重要作用，所以正常血清皮质醇平衡受到环境中皮质醇干扰将可能引起洄游鱼类的渗透压平衡调节失败。目前对鱼类渗透压调节机制的研究已深入到分子水平，研究表明硬骨鱼鳃内Ｎａ＋．Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅａ和Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅＢ基因表达与对渗透压调节起关键性作用的Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰ酶活性密切相关，并且皮质醇经糖皮质激素受体（ＧＲ）介导，调控Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅａ和Ｎａ＋一Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅ１３基因的表达。但对水环境中皮质醇影响鳃内ＧＲ、Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅａ和Ｎａ＋一Ｋ十一ＡＴＰａｓｅ１３基因表达的研究未见报道。为此，本文以青鲻鱼为实验动物，从基因表达角度，对皮质醇影响鱼类鳃内ＧＲ、Ｎａ＋－Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅａ和Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅＢ基因表达进行了研究。本文将生物信息学和分子生物学技术结合，克隆得到青鲔鱼Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ、Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅＢ和ＧＲ三个基因的序列片段，并经过分析得到证实。成功的建立了青鳝鱼Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅａ、Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ和ＧＲ基因表达的实时定量ＲＴ－ＰＣＲ钡ｉＪ定方法。应用此方法检测到Ｎａ＋一Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅａ、Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅＢ、ＧＲ三个基因在青鳝鱼鳃、脑、眼睛、肠、肌肉、肝和脾内都表达。并且Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ在青鲻鱼的各组织内表达水平是鳃＞肠一肝＞脾＞肌肉＞眼睛＞脑，Ｎａ＋一Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅＢ基因在各组织中表达强弱顺序是肠＞脾＞鳃＞肌肉一肝＞眼睛＞脑，ＧＲ基因表达量是鳃＞肠。肝＞脾＞肌肉＞ｌｌｔｉ睛＞脑。本结果为研究鱼类渗透压调节、免疫抑制、神经细胞兴奋的分子机制等提供基础数据。本试验结果表明，适应１５９／Ｌ盐水的青鲻鱼，鳃内Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅａ、ＧＲｍＲＮＡ水平显著升高，Ｎａ＋．Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅＢ基因表达无显著性变化。将其转回淡水中，在不同时间段检测其鳃内三个基因表达的变化，Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅａｍＲＮＡ水平１２ｄ，时降到低谷，而后随时间的增长逐渐恢复正常，即随时间变化成“ｕ”形趋势；Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ１３基因的表达水平和盐水组相比变化不显著；ＧＲ基因表达水平急剧降低，但随时间的延长，ＧＲ基因表达水平逐渐增加。此结果对阐明鱼类渗透压调节的分子机制有重要作用。本文将适应１５９／Ｌ盐水的青鳓鱼，转入含有皮质醇（０．０１、０．１、１、１０、１００ｐｇ／Ｌ）的淡水中，暴露４８，Ｊ，时，发现含有０．１．１００ｕｇ／Ｌ浓度的皮质醇阻止鳃内Ｎａ＋．Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅＧＲａ、ｍＲＮＡ水平的回落。基于本实验结果，并参考前人研究成果，本文认为淡水中含０．１ｕｇ／Ｌ以上浓度皮质醇，将对洄游鱼类由海洋进入江河过程中渗透压的正常调节构成潜在危害性。ｌＩ青鲻鱼鳃内Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ基因的克隆及皮质醇对其表达的影响关键词：皮质醇；钠钾ＡＴＰ酶；糖皮质激素受体；基因表达；青鲻鱼英文摘要ＣＩｏｎｉｎｇｏｆｍｅｄａｋａｓｏｎｅｏｎｇｉ｜｜Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｇｅｎｅｓ：ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｏｎｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉＩｅｘｐｒｅｓｓｉＡＢＳＴＲＡＣＴＨｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ，ａｓａｎｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｐｏｌｌｕｔａｎｔ，ｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｉｔｓｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｔｏｘｉｃｉｔｙｈａｓａｎｏｔｂｅｅｎｒｅｐｏｒｔｅｄ．Ｎｏｒｍａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｃｏｒｔｉｓｏｌｉｎｓｅｒｕｍｐｌａｙｓｃｒｉｔｉｃａｌｒｏｌｅｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｓａｔｕｒａｔｉｏｎｂａｌａｎｃｅｆｏｒｍｉｇｒａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆｆｉｓｈ，ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｏｆｎｏｒｍａｌＳｅｌ＇ｎｍｃｏｒｉｔｓｏｌｂａｌａｎｃｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｃｏｒｔｉｓｏｌｃｏｕｌｄｐｏｓｓｉｂｌｙｃａｕｓｅｔｈｅｆａｉｌｕｒｅｏｆｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｓａｔｕｒａｔｉｏｎｐｒｅｓｓｕｒｅｆｏｒｍｉｇｒａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆｆｉｓｈ．Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ，ｓｔｕｄｙｏｆｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｓａｔｕｒａｔｉｏｎｐｒｅｓｓｕｒｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎｆｉｓｈｈａｖｅｒｅａｃｈｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｅｖｅｌ，ｉｔｓｈｏｗｓｔｈａｔｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＮａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｃａａｎｄＢａｒｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＮａ＋Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｗｈｉｃｈｉｓｃｒｉｔｉｃａｌｔｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｓａｔｕｒａｔｉｏｎｐｒｅｓｓｕｒｅ，ａｎｄｃｏｒｔｉｓｏｌｉｓｍｅｄｉａｔｅｄｂｙａｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＲ），ｗｈｉｃｈｒｅｇｕｌａｔｅｓｇｅｎｅｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ．Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａｎｄＢ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｃｏｒｔｉｓｏｌａｔｈｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＲ，Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｓａｎｄｇｉｎｔｈｅｇｉｌｌｈａｖｅｎｏｔｂｅｅｎｒｅｐｏｒｔｅｄ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｍｅｄａｋａｗｅｒｅａｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｎｉｍａｌｓ，ｉｎｏｎｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｕｄｙｉｓａｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｏｒｔｉｓｏｌＣｏｍｂｉｎｅｄｔｈｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＮａ＋Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａｎｄＢ，ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｗｉｔｈｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｅｇｍｅｎｔｓｏｆａｔｈｒｅｅｇｅｎｅｓｏｆＧＲ，Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅａｎｄＢｈａｖｅｂｅｅｎｃｏｌｏｎｅｄａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙａａｎａｌｙｓｉｓ．ａｎｄＢｉｎＲｅａｌ－ｔｉｍｅＲＴ－ＰＣＲｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＲ．Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｃｔｈｅｍｅｄａｋｈａｓｂｅｅｎｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙａｐｐｌｙｉｎｇｔｈｅａｂｏｖｅｍｅｔｈｏｄ，ＩｔｓｕｇｇｅｓｔｓｔｈａｔｔｈｒｅｅｇｅｎｅｓｏｆＧＲ，Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅａａｎｄＢａｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｇｉｌｌ，ｂｒａｉｎ，ｅｙｅ，ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ，ｍｕｓｃｌｅ，ｌｉｖｅｒａｎｄａｓｐｌｅｅｎ；ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＮａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅｇｅｎｅｉｎｖａｒｉｏｕｓｔｉｓｓｕｅｓａｒｅ：ｇｉｌｌ＞ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ。ｌｉｖｅｒ＞ｅｙｅ＞ｂｒａｉｎ．ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＮａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢｉｎｖａｒｉｏｕｓｔｉｓｓｕｅｓａｒｅ：ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ＞ｓｐｌｅｅｎ＞ｇｉｌｌ＞ｍｕｓｃｌｅ—ｌｉｖｅｒ＞ｅｙｅ＞ｂｒａｉｎ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＧＲｇｅｎｅｉｎｖａｒｉｏｕｓｔｉｓｓｕｅｓａｒｅ：百１１＞ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ＋ｌｉｖｅｒ＞ｍｕｓｃｌｅ＞ｅｙｅ＞ｂｒａｉｎ．ＴｈｅａｂｏｖｅｒｅｓｕｌｔｓｗｉｌｌｐｒｏｖｉｄｅｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｄａｔａｆｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｔｕｄｙｏｆｓａｔｕｒａｔｉｏｎｐｒｅｓｓｕｒｅｃｅｌｌｅｘｃｉｔａｔｉｏｎａｎｄＳＯｏｎ．ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｉｍｍｕｎａｌｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ｎｅｕｒａｌＴｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈｒｅｓｕｌｔＮａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈａｔａｆｔｅｒａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎｔｏｓａｌｉｎｅｗａｔｅｒｏｆ１５９／Ｌ，ｌｅｖｅｌｓｏｆａｎｄＧＲｍＲＮＡｉｎｔｈｅｇｉｌｌｉｎｃｒｅａｓｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ，ａｎｄｌｅｖｅｌｓｏｆＮａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢｍＲＮＡｖａｒｙｔｏｉｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．Ａｆｔｅｒｍｅｄａｋｉｎｓａｌｉｎｅｗａｔｅｒｏｆ１５９／Ｌｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｔｈｒｅｅｇｅｎｅｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｎｔｅｒｖａｌｏｆｔｉｍｅ．