第三军医大学硕士学位论文增体系、三蒸水、酶、上下游引物）预先在ＰＣＲ管中加好，进行ＰＣＲ反应前不再加模板。预加引物组、正常对照组和预加体系组采用１０ｕｌ三蒸水稀释直径Ｉｍｍ带有ｐｕｃｌ８质粒的ＤＨ５ａ菌株的单菌落为ＰＣＲ反应模板，每次反应用量１“ｌ。３．为取消加样完毕后进行ＰＣＲ前的短暂离心步骤，我们设计了如下实验，并根据ＰＣＲ反应中对加样操作简化的方式不同分为如下三组：预加体系组：本组直接ＰＣＲ反应体系（含１号直接ＰＣＲ扩增体系、三蒸水、酶、上下游引物）预先在ＰＣＲ管中加好，进行ＰＣＲ反应前只须再加模板１ｕｌ，经短暂离心，行热循环扩增。预加体系组＋矿物油组：本组直接ＰＣＲ反应体系（含１号直接ＰＣＲ扩增体系、三蒸水、酶、上下游引物、一滴矿物油）预先在ＰＣＲ管中加好，进行ＰＣＲ反应前只须再加模板１ｕｌ，不进行短暂离心，直接行热循环扩增。阴性对照组，该组不加模板。预加体系组和预加体系组＋矿物油组采用１０ｕｌ三蒸水稀释直径ｌｍｍ带有ｐＵＣｌ８ｌａ质粒的ＤＨ５ｄ菌株的单菌落为ＰＣＲ反应模板，每次反应用量１ｌ。４．为省略ＰＣＲ结果检测中的电泳检测步骤，我们采用能与ＤＮＡ双链非特异结合的ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ荧光染料，设计了如下实验，并根据反应加样不同分为如下三组：阴性对照组ｌ：本组直接ＰＣＲ反应体系（含ｌ号直接ＰＣＲ扩增体系、三蒸水、酶、上下游引物、２ｐＪＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ和一滴矿物油）预先在ＰＣＲ管中加好，进行ＰＣＲ反应前不再加模板。阴性对照组２：本组直接ＰＣＲ反应体系（含１号直接ＰＣＲ扩增体系、三蒸水、上下游引物、２ｕｌＳＹＢＲＧｒｅｅｎｕＩ和一滴矿物油）预先在ＰＣＲ管中加好，进行ＰＣＲ反应前只须再加模板１ｌ，不加ＤＮＡ聚合酶。正常对照组：本组直接ＰＣＲ反ｕ１应体系（含１号直接ＰＣＲ扩增体系、三蒸水、酶、上下游引物、２滴矿物油）预先在ＰＣＲ管中加好，进行ＰＣＲ反应前只须再加模板ｌ四、反应体系及循环步骤１．所有使用直接ＰＣＲ扩增体系的反应体系同第一部分。２．反应循环参数同第一部分。五、１．５％凝胶糖凝胶电泳检测ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ和一ｕ１。１．将１．５％琼脂糖凝胶在微波炉中煮沸、混匀，在胶床上制备胶板。２．产物检测：取５ｕＩＰＣＲ产物与１ｕ１上样缓冲液混匀，小心加样于置在电泳槽第三军医大学硕士学位论文内以１×ＴＡＥ电泳缓冲液浸盖的１．５％琼脂糖凝胶（含溴化已锭Ｏ．５ｕｇ／ｍ１）胶孔中，同时以电泳Ｍａｒｋｅｒ点样。加样完毕，行电泳（恒压８０Ｖ），电泳约２０．３０分钟，至溴酚蓝位于琼脂糖凝胶的２／３后结束电泳，紫外灯下观察，见出现结果和Ｍａｒｋｅｒ分开良好，用凝胶成像扫描仪紫外透射下扫描成像记录实验结果。结果一、检验该直接ＰＯＲ扩增体系用于多重ＰＣＲ的能力直接ＰＣＲ扩增体系采用能对三蒸水稀释的菌液模板进行最佳扩增的ｌ号。结果在各自对应的反应循环条件下，三组引物都能直接良好扩增相应的目的核酸片段。在ｐＵＣｌ８引物和Ｅ．ｃｏｌｉ引物对应的相同扩增循环条件下，进行双重ＰＣＲ扩增，电泳结果仅显示一条带，对应位置为ｐＵＣｌ８引物扩增产物。在１６ｓＲＮＡ引物对应的循环条件下，对三组引物进行三重ＰＣＲ扩增，电泳结果显示为两条带，对应位置为ｐＵＣｌ８引物扩增产物和１６ｓＲＮＡ引物扩增产物。阴性对照无明显条带，如图所示（图１９）。二、检验进一步简化加样操作对扩增结果的影响结果阴性对照组１、２均无明显条带，预加引物组、预加体系组和正常对照组都能进行良好扩增，且条带亮度并无明显差异，如图所示（图２０）。三、检验取消加样完毕后进行ＰＯＲ前的短暂离心步骤对扩增结果的影响结果阴性对照组无明显条带，而预加体系组和预加体系十矿物油组条带清晰锐利，且亮度无明显差异。如图所示（图２１）。四、检验省略常规ＰＣＲ结果判读中的电泳检测步骤，能否直接判读扩增结果。结果阴性对照组１无明显荧光，而阴性对照组２和正常对照组荧光强度均很高。如图所示（图２２）。本部分实验结果表明，该直接ＰＣＲ扩增体系能满足同时对２—３个不同目的核酸片段单管扩增的要求，即该体系能满足直接多重ＰＣＲ的检测需要。从简化操作步骤角度看，将引物或除模板外的整个反应体系预先加入到反应管中，对检测结果并无明显影响。而将除模板外的整个反应体系预先加入到反应管中，滴加矿物油覆盖，反应前再加模板，省略加样后进行ＰＣＲ热循环扩增前的短暂离心，对检测也无明显影响。但是采用与ＤＮＡ双链非特异结合的ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ荧光燃料进行结果判读，则因背景太高，无法与进行ＰＣＲ扩增后ＤＮＡ双链量进～步增多相区别。第三军医大学硕士学位论文讨论一、该直接ＰＯＲ扩增体系用于多重ＰＣＲ检测ＰＣＲ作为一种灵敏、高效、常用的诊断手段，常常受标本量过少及检测成本太高的限制。在对同一标本进行多个指标的检测时，多重ＰＣＲ是一种很好的选择［３２】。多重ＰＣＲ通过在反应体系中加入多对引物，分别针对不同的目的核酸片段，单管同时进行扩增，实现一次反应同时检测多个基因的目的。多重ＰＣＲ可以明显的节省ＰＣＲ诊断所需的时间和费用，同时保证了ＰＣＲ诊断的特异性和敏感性口２１”】。所以，多重ＰＣＲ自发现以来，就被广泛应用于基因缺失筛检、突变和多态性分析、基因表达量相对比较和感染性疾病病因检查【３２。”Ｊ。由于多重ＰＣＲ在单管中同时扩增多个基因，其功能的强大决定了对其反应参数必然有着更高的要求盼３４’３５］：（１）引物由于多重ＰＣＲ反应体系中存在多对引物，要使各对引物都能有效扩增，不仅要求每对引物自身不存在二聚体、发夹结构和非特异扩增等严重影响引物扩增效能的不良结构，还要求各对引物间不存在影响引物扩增效能的引物间二聚体；各对引物的扩增效能要尽量一致，以免反应中出现明显的ＰＣＲ偏移（在一个多重ＰＣＲ反应体系中，其中有的目的基因能得到有效扩增，而另外的目的基因扩增效能低下），这就要求所使用的各引物对在退火温度上彼此接近且所扩增的目的片段的长度和ＧＣ含量比较一致。（２）ＤＮＡ聚合酶在多重ＰＣＲ反应体系中，应当适当增加所添加的聚合酶量。一般情况下，对于同时扩增７—１０个目的ＤＮＡ片段的多重ＰＣＲ反应体系，所使用的酶量应当在进行单一目的基因扩增所使用酶量的４．５倍。（３）ｄＮＴＰｓ由于多重ＰＣＲ单管同时扩增多个目的片段，因此，ＰＣＲ反应所需要的底物也比进行单一目的基因扩增时要多，故ｄＮＴＰｓ量应当增加。（４）同时，由于ｄＮＴＰｓ和Ｍ９２＋是等摩尔比结合的，多重ＰＣＲ反应体系中的Ｍ９２＋的浓度也应当适当提高。通常情况下，仅仅通过一般的引物设计和生物信息学分析，并不能真正有效的保证多重ＰＣＲ反应系统中各引物对都能有效扩增，因此，在进行多重ＰＣＲ前，应当进行一定的预实验，进行引物对的单一扩增和不同搭配组合，最终摸索出一套有效的有价值的多重ＰＣＲ检测系统来［３４－３６］。目前，逆转录ＰＣＲ也能进行多重ＰＣＲ／３７’３８１。多重ＰＣＲ能够在单一管中同时检测多个目的核酸片段，在生物战剂现场快速检测，及时明确敌人所用的生物战剂种类，有效指导防护和救治工作开展方面非常适用。与一般ＰＣＲ相比，多重ＰＣＲ除了对所用引物有较高要求外，通常还需对反应系统进行适当调整，如增３［１Ｍｇ”和ｄＮＴＰｓ，尤其是单管扩增的分子种类较多时。在本部分实验中，第三军医大学硕士学位论文我们选择以１号直接ＰＣＲ扩增体系对三蒸水稀释的带有ｐＵＣｌ８质粒的ＤＨ５ａ菌株的单菌落菌液模板，进行了针对ｐＵＣｌ８质粒、ＤＨ５ｄ菌株和１６ＳＲＮＡ的单一、双重和三重ＰＣＲ扩增，实验结果表明，在各自最佳的反应循环条件条件下，单一扩增都能有效进行。由于ｐＵＣｌ８引物和Ｅ．ｃｏｌｉ９｛物的扩增产物长度分别为３４７ｂｐ和３９８ｂｐ，比较接近，循环条件一致，进行双重ＰＣＲ扩增后，电泳结果却仅显示为一条带，对应位置为ｐＵＣｌ８引物扩增产物，可能是出现明显的ＰＣＲ偏移或是因扩增产物长度过于接近，电泳后分辨不是很明显。因１６ｓＲＮＡ引物对应的扩增片段长度１４８４ｂｐ，故进行三重ＰＣＲ扩增选用的为１６ＳＲＮＡ引物对应热循环条件。扩增后行凝胶电泳判读结果可见很明显的两条带，对应位置分别为ｐＵＣｌ８引物扩增产物和１６ＳＲＮＡ引物扩增产物，三重ＰＣＲ扩增能有效扩增出１６ＳＲＮＡ引物扩增产物，使双重ＰＣＲ扩增电泳结果却仅显示为一条带，出现明显的ＰＣＲ偏移为其原因的可能性大大降低。该结果也表明，该直接ＰＣＲ扩增体系能适应单管对至少两到三个目的核酸片段的直接同时扩增。当同时对更多的目的核酸片段进行检测时，要结合多重ＰＣＲ研究积累的经验对引物进行优化，对体系作适当调整。该直接ＰＣＲ扩增体系能够满足同时检测２．３个不同目的核酸片段的要求，适当调整其相关成分的浓度，应该也能检测更多的目的核酸片段。采用直接ＰＣＲ扩增体系，基于直接多重ＰＣＲ技术，完全能够开发出同时检测１０－２０种危害最高生物战剂的便携式现场快速检测装置。要能够同时检测近４００种不同的生物战剂，采用多重ＰＣＲ将可能因为反应条件不易协调而难以做到，但是可通过开发现场生物战剂自动化检测系统的方式来解决。反应分不同的管进行，每管只检测一种特定生物战剂，只是在选择引物时候，可以借鉴多重ＰＣＲ系统的引物设计经验，使针对这近４００：种生物战剂不同特异目的核酸片段扩增所用引物的反应循环参数尽量一致即可。二、简化加样操作对现场快速检测的影响常规ＰＣＲ的加样比较复杂，而且每加完一种ＰＣＲ成分，通常须更换吸头。加样操作步骤过多，不仅增加了操作时间，还可能因为人为加样的频繁导致假阳性结果的产生。本部分的研究结果表明，将引物预先加入到反应管中，或进一步将除模板外的整个反应体系加入到反应管中，反应前再加模板，与正常采用直接ＰＣＲ扩增体系相比，检测结果经琼脂糖凝胶电泳观察并无明显差异。通常情况下，加样完毕，须经短暂离心使所加成份在管底混合均匀，以便ＰＣＲ反应成分充分混合。将预加体系组与预加体系组＋矿物油组比较，加矿物油后，因为矿物油密度小，且与反应体系其他成份分相，因此，无须离心，所加反应成份便将在重