第三军医大学硕士学位论文三蒸水组和生理盐水组的差别仅在渗透压部分，三蒸水为低渗液而生理盐水为等渗液。理论上讲，选择三蒸水稀释标本选择应当较生理盐水对细菌裂解更为有效，但是考虑到４０ｐ１反应体系中，模板用量仅为ｌＨｌ，而ＮａＣｌ对ＰＣＲ反应又不是明显的抑制剂，故二者实质上差别并不明显。而尿液和抗凝全血则因成分复杂，可能含有抑，！｜ｖｃａ反应中ＤＮＡ聚合酶的活性的物质口“。这部分实验结果表明，该直接ＰＣＲ扩增体系的适用范围存在一定的限制。对于待检测的标本，如果其模板含量较高，可以三蒸水或生理盐水稀释后进行扩增；如果模板含量较低，且样品成分复杂，可能含有明显抑制ＰｃＲ反应的物质，则应在反应前进行对样品中的模板浓缩富集，富集后再以三蒸水或生理赫水稀释稀释，以减少加入到ＰＣＲ反应体系中的抑制ＰＣＲ反应的物质浓度。二、对不同细胞类型的模板，直接ＰＯＲ扩增体系能进行有效直接扩增使用直接ＰＣＲ扩增体系对噬菌体、细菌和真核细胞目的核酸片段进行了扩增，扩增结果表明，该直接ＰＣＲ扩增体系对细菌、噬菌体等原核细胞中的目的核酸片段扩增效果良好，而对真核细胞中的目的核酸片段能进行有效扩增，但是结果不佳。这里面可能存在模板拷贝数的影响，因为三蒸水稀释的单菌落、培养的噬菌体，其模板拷贝数均很高，而真核细胞的拷贝数仅为１０３．１０４。另外一个主要影响因素是细胞类型本身对扩增效果的影响。原核细胞ｆ噬菌体和细菌）无明显染色体结构，其目的核酸分子的释放仅仅需要破壁，这对在低渗液中稀释，预变性高温等反应条件来说，破壁不是很困难，该直接ＰＣＲ扩增体系对三蒸水稀释的原核细胞的目的核酸分子能进行良好扩增证实了这点。而对真核细胞来说，其目的核酸分子的释放则不仅要破细胞膜，同时还需解开复杂的染色体结构，这对不加任何其他可能影响ＰＣＲ反应效率的变性剂的直接ＰＣＲ扩增体系来说，可能稍微有些困难，从而使实验中真核细胞模板的有效拷贝数进一步降低，并影响到了扩增效果（显带是否清晰锐利１。不过，该直接ＰＣＲ扩增体系对原核细胞中的目的核酸片段进行能够良好扩增，表明该系统可以应用于感染性疾病（主要致病因素为细菌或病毒等原核生物）及生物战剂（主要致病因素为细菌或病毒等微生物）的快速检测。最具威胁的生物战剂散播方式为气溶胶［９１，对生物战剂的检测通常要进行采样，即对含气溶胶空气的采集。气溶胶式散布的生物战剂的致病能力通常在１０１．１０３／Ｌ口’９、３９】，适当控制空气样品采集装置的工作时间，很容易便可达到直接ＰＣＲ扩增体系的灵敏检测范围。结合前面对不同溶液稀释的细菌菌液模板扩增情况来看，在开发生物战剂现场快速检测装置时，样品采集装置的稀释液最好选择三蒸水，如果所采集富集后第三军医大学硕士学位论文的样品同时需要分装后送以便进行常规的培养检查时，则也可选择生理盐水。三、与现有试剂盒作对照，直接ＰｃＲ扩增体系对临床淋球菌阳?｜生标本能进行高灵敏、高特异扩增对５例临床检查淋球菌阳性的患者标本迸行ＰＣＲ扩增时，直接ＰＣＲ扩增体系对经过或未经现有淋球菌ＰＣＲ快速检测试剂盒的ＤＮＡ释放处理步骤的标本都能有效扩增。因为在该试剂盒对标本的处理过程中，通过裂解离心稀释部分，对标本进行了６倍左右浓缩，而在加样时加２ｕｌ，又增加了两倍，考虑样本预处理过程中可能存在核酸分子丢失，总体上对标本进行了约１０倍的核酸富集。而采用直接ＰＣＲ扩增体系，则能够达到同样的灵敏度检测，而且大大简化了对样品的操作，减少了检测过程中人为污染导致的假阳性的发生。以试剂盒所带阳性对照为模板，采用直接ＰＣＲ扩增体系，使用自己设计合成的引物，并不能有效扩增。结合所得实验结果看，可能该阳性对照为试剂盒所用引物的扩增产物，而非淋球菌总ＤＮＡ。结合前面对不同溶液稀释的细菌菌液模板扩增情况来看，如要开发感染性疾病快速诊断试剂盒，对样品来源有一定要求。对尿液、血液、脑脊液、胸腔液等来源的标本，由于其成分复杂，可能含有对ＰＣＲ反应具有明显抑制作用的物质，这可能要求我们对直接ＰＣＲ扩增体系进一步优化，或者增加适当简易的标本预处理过程。采用第一部分建立的直接ＰＣＲ扩增体系，我们对噬菌体（病毒）、带有ｐＵＣｌ８质粒的ＤＨ５。菌株（细菌）等原核细胞及真核生物细胞（人Ａ５４９细胞）进行了直接ＰＣＲ扩增，证实该直接ＰＣＲ扩增体系对原核细胞和真核细胞的目的核酸片段都能有效扩增。其中对原核细胞适用，则表明该系统可以用来开发感染性疾病快速诊断试剂盒或开发生物战剂的现场快速检测装置。采用第一部分建立的直接ＰＣＲ扩增体系，我们对三蒸水、生理盐水、尿液、血液等不同溶液稀释的带有ｐＵＣｌ８质粒的ＤＨ５ｎ菌株菌液进行了直接ＰＣＲ扩增，并证实该直接ＰＣＲ扩增体系能有效扩增目的核酸，其扩增灵敏度为三蒸水，生理盐水＞尿液＞血液。这不仅为我们初步探讨了该直接ＰＣＲ扩增体系的应用范围，还为我们下一步开发生物战剂现场快速检测装置时，为样本采集装置选择适当溶液作样本溶解体系提供了实验依据。我们还将此直接ＰＣＲ扩增体系与国产的淋球菌４℃ＰＣＲ检测试剂盒作对比，并证实该直接ＰＣＲ扩增体系的扩增特异性良好，且检测灵敏度有一定提高。第三军医大学硕士学位论文第三部分直接ＰＣＲ扩增体系现场快速检测应用性研究现场快速检测通常需要简化操作步骤、节省检测时间、减少所用仪器、降低检测成本，同时在检测的灵敏度和特异性上不得降低，针对生物战剂的现场快速检测更是如此。与常规ＰＣＲ检测相比，采用直接ＰＣＲ扩增体系，已经初步满足上述需求。在此部分，我们着重从检验该直接ＰＣＲ扩增体系同时直接扩增多个目的核酸片段的能力，进一步简化操作步骤，减少所用仪器等三个方面对直接ＰＣＲ扩增体系现场快速检测应用性进行了一定探索。又因针对生物战剂的检测不仅要明确敌人是否使用了生物战剂，还要明确使用了何种生物战剂，我们还分析了今后研发生物战剂现场快速检测装置的可行性。材料与方法一、主要仪器、试剂及其配制：ＰＣＲ反应及结果检测部分主要仪器、试剂及其配制同第一部分和第二部分，其中矿物油为第二部分中国产淋球菌４。ＣＰＣＲ检测试剂盒所配带，ＳＹＢＲ料由本校分子遗传教研室惠增，浓度为５０ｕＧｒｅｅｎＩ荧光染ｇ／ｍｌ。二、细菌、细胞培养及其他相关准备工作：（１）带有ｐＵＣｌ８质粒的ＤＨ５Ｑ菌株划线于含氨苄青霉素的ＬＢ琼脂板上，３７。Ｃ培养过夜。（２）在超净工作台上，以接种针分别挑取１个单菌落溶于含１０ｕ１生理盐水的２０个ＥＰ管中，置４℃保存，各后续直接ＰＣＲ使用。（３）引物设计本部分采用所用引物第一部分的两对引物，引物设计同第一部分。引物序列：ｐＵＣＩ８（Ｌ０８７５２）Ｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ：Ｐｒｏｄｕｃｔ：３４７ｂｐ５７ＡＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＧＣＧｌ：ＡＴＴＧＧ３７５’ＧＧＣＡＧＧＧＴＣＧＧＡＡＣＡＧＧＡＧＡ３７Ｔａ：５７．９℃Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＥ００５１７７）第三军医大学硕士学位论文Ｓｅｎｃｅｐｒｉｍｅｒ：５５ＡＴＣＡＡＣＣＧＣＡＧＧＡＴＧＣＣＡＣＡＡＣＧＡＡＣＡＧＣＡＧＧＧＴＣＡＧＧＴＴＡＣＡＧ３７Ａｎｔｉｓｅｎｃｅｐｒｉｍｅｒ：Ｐｒｏｄｕｃｔ：３９８ｂｐ３Ｔａ：５４．６℃１６ｓＲＮＡ（ＡＥ００５１７７）Ｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ：５５７ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ７３Ａｎｔｉｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ：Ｐｒｏｄｕｃｔ：１４８４ｂｐＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣ３’Ｔａ：５５．４℃（４）引物稀释所订购引物经核对序列无误后，高速离心机上短暂离心，小心打开，每管加三蒸水２００“ｌ溶解，浓度约为２５终浓度为Ｏ．５ｕｕＭ，在５０ｕ１的ＰＣＲ反应体系中，每次用１ｕ１，引物Ｍ，盖紧盖子，剧烈震荡混匀，置一２０℃保存备用。三、实验分组设置：１．为检验该直接ＰＣＲ扩增体系用于多重ＰＣＲ的能力，根据ＰＣＲ反应中所采用的引物不同分为如下六组：ｐＵＣｌ８组：引物采用ｐＵＣｌ８（Ｌ０８７５２）。Ｅ．ｃｏｌｉ组：引物采用Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＥ００５１７７）。１６ＳＲＮＡ组：引物采用１６ｓＲＮＡ（ＡＥ００５１７７）。双重ＰＣＲ组：引物采用ｐＵＣｌ８（Ｌ０８７５２１和Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＥ００５１７７）。三重ＰＣＲ组：引物采用ｐＵＣｌ８（Ｌ０８７５２）、Ｅ．ｅｏｌｉ（ＡＥ００５１７７）和１６ｓＲＮＡ（ＡＥ００５１７７）。阴性对照组：体系同前，不加任何引物。模板采用１０ｕｌ三蒸水稀释直径ｈｎｍ带有ｐＵＣｌ８质粒的ＤＨ５ｄ菌株的单菌落菌液，每次反应用量１接ＰＣＲ扩增体系采用能对三蒸水稀释的菌液模板进行最佳扩增的１号。２，为检验进一步简化加样操作对扩增结果的影响，我们设计了如下实验，并根据ＰＣＲ反应中对加样操作简化的方式不同分为如下五组：预加引物组：在ＰＣＲ管中预先加好上下游引物各１ｕｕｌ，直ｌ，以矿物油１滴覆盖；进行ＰＣＲ反应前再加模板、ｌ号直接ＰＣＲ扩增体系、三蒸水、酶。正常对照组：和第一部分、第二部分中采用直接ＰＣＲ扩增体系的加样情形一样。预加体系组：本组直接ＰＣＲ反应体系（含１号直接ＰＣＲ扩增体系、三蒸水、酶、上下游引物）预先在ＰＣＲ管中加好，进行ＰＣＲ反应前只须再加模板１ｕ１。阴性对照组１：在ＰＣＲ管中预先加好上下游引物各ｌｕ１，以矿物油１滴覆盖：进行ＰＣＲ反应前再加优化后ｌ号直接ＰＣＲ扩增体系、三蒸水、酶，不加模板。阴性对照组２：本组直接ＰＣＲ反应体系（含１号直接ＰＥＲ扩