第三军医大学硕士学位论文表４中加样顺序为左边列中由上至下的顺序；每次ＰＣＲ反应均须设置至少一管为阴性对照组；加样在冰水浴状态下进行：所用试剂添加前经短暂离心：试剂添加完毕，盖好标记好的ＰＣＲ反应管后，将ＰＣＲ反应管置高速离心机上短暂离心，然后置入ＦＸ．２５００基因扩增仪；根据不同的引物在表５中所对应的扩增方案，行ＰＣＲ扩增。２．反应循环参数为：表５ＰＣＲ扩增方案五、１．５％凝胶糖凝胶电泳检测扩增结果（１）将１．５％琼脂糖凝胶在微波炉中煮沸、混匀，在胶床上制各胶板。（２）产物检测：取５ｕｌＰＣＲ产物与１ｕｌ上样缓冲液混匀，小心加样于置在电泳槽ｕ内以ｌ×ＴＡＥ电泳缓冲液浸盖的１．５％琼脂糖凝胶（含溴化已锭０．５ｇ／ｍ１）胶孔中，同时以电泳Ｍａｒｋｅｒ点样。加样完毕，行电泳（恒压８０ｖ），电泳约２０．３０分钟，’紫外灯下观察，见出现结果和Ｍａｒｋｅｒ分开良好，用凝胶成像扫描仪紫外透射下扫描成像记录实验结果。结果一、ｐＵ０１８（Ｌ０８７５２）、Ｅ．ＣＯ｜ｉ（ＡＥ００５１７７）和１６ｓＲＮＡ（ＡＥ００５１７７）引物组的退火温度优选以经提取纯化的ＤＮＡ为模板，根据不同的扩增对象，采用不同的引物，分为ｐＵＣｌ８（Ｌ０８７５２）２３Ｉ物组、Ｅ．ｃ０１ｉ（ＡＥ００５１７７）引物组和１６ｓＲＮＡ（ＡＥ００５１７７）弓Ｉ物组，再根据引物设计时软件推荐的退火温度，以２℃为梯度改变退火温度，以表４中的１０ＸＢ类ＰＣＲ反应缓冲液组反应体系，改变表５中的退火温度，经实验证实，退火温度设置在５１。５５℃范围内，三组引物均扩增效果良好，而采用ＰＣＲ添加剂后，因ＰＣＲ添加剂第三军医大学硕士学位论文通常能促进高ＧＣ含量区的解链，退火温度通常需较普通ＰＣＲ扩增的退火温度下降１．２℃，故对这三组引物，采用２×ＰＣＲ反应缓冲液组反应体系时，退火温度均选择在５３℃。模板采用ＴＩＲ提取纯化后的ＤＮＡ，以１０×Ｂ类ＰＣＲ反应缓冲液组组建反应体系时，退火温度选择在５ｌ，５５℃，三组引物都能良好扩增，如图ｌ所示。二、以直接ＰＣＲ组菌液为模板，观察三组反应体系对扩增效果的影响选用Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＥ００５１７７）弓１物组，以直接ＰＣＲ组菌液为模板，根据２ＸＰＣＲ反应缓冲液不同进行分组，即ＤＭＳＯ组、ｂｅｔａｉｎｅ组和ＭｇＣｌ２组共三组（每组１０种），每组的阴性对照均不加模板，反应体系分别以三类２×ＰＣＲ反应缓冲液组中第Ｅ种组建。加样完毕，行ＰＣＲ循环扩增。扩增完毕，行１．５％凝胶糖凝胶电泳检测扩增结果，结果１０种ＤＭＳＯ组２×ＰＣＲ反应缓冲液均不能扩增出特异核酸片段，而１０种ｂｅｔａｉｎｅ组２×ＰＣＲ反应缓冲液和１０种ＭｇＣｌ２组２×ＰＣＲ反应缓冲液均能有效扩增出特异核酸片段。如图所示（图２、３、４）。因凝胶胶孔数目限制，所有伴ＰＣＲ进行的阴性对照管无法在结果图中显示，经电泳证实，所有阴性对照管均无特异条带产生（结果未记录）。三、ｂｅｔａｉｒｌｅ组反应体系对不同目的核酸片段的扩增效果选用Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＥ００５１７７）弓ｌ物组，以ｂｅｔａｉｎｅ组２×ＰＣＲ反应缓冲液组建反应体系，采用标记为Ｂ，各后续直接ＰＣＲ使用的菌液为模板，模板用量为１ｕｌ，加样完毕，行ＰＣＲ循环扩增。扩增完毕，行１．５％凝胶糖凝胶电泳检测扩增结果。结果ｌＯ种ｂｅｔａｉｎｅ组２ｘＰＣＲ反应缓冲液对目的核酸片段都能良好扩增，如图所示（图５）。’选用ｐＵＣ］８（Ｌ０８７５２）弓Ｉ物组，以ｂｅｔｍｎｅ组２ＸＰＣＲ反应缓冲液组建反应体系，采用标记为Ｂ，备后续直接ＰＣＲ使用的菌液为模板，模板用量为ｌｐｌ，加样完毕，行ＰＣＲ循环扩增。扩增完毕，行１．５％凝胶糖凝胶电泳检测扩增结果。结果１０种ｂｅｔａｉｎｃ组２×ＰＣＲ反应缓冲液对且的核酸片段都能良好扩增，如图所示（图６）。选用１６ｓＲＮＡ（ＡＥ００５１７７）引物组，以ｂｅｔａｉｎｅ组２×ＰＣＲ反应缓冲液组建反应体系，采用标记为Ｂ，备后续直接ＰＣＲ使用的菌液为模板，模板用量为ｌ“ｌ，加样完毕，行ＰＣＲ循环扩增。扩增完毕，行１．５％凝胶糖凝胶电泳检测扩增结果。结果１０种ｂｅｔｍｎｅ组２ＸＰＣＲ反应缓冲液对目的核酸片段都能良好扩增，如图所示ｆ图７１。每进行一次ＰＣＲ上机反应，均设置了阴性对照组，管内不加模板，因记录结果时受胶ｉＬ数目限制，通常未将阴性对照管电泳结果记录，但经电泳证实，所有阴性对照管均不能扩增出特异核酸片段。本部分实验结果表明，采用普通的ＰＣＲ反应体系，能够从经ＴＩＲ提取纯化后的６第三军医大学硕士学位论文ＤＮＡ模板中扩增出目的核酸片段，而不能从未经核酸提取纯化预处理的菌液中扩增出目的核酸片段。添加ＤＭＳＯ后，上述情况无明显改变，而添加ｂｅｔａｉｎｅ后，则不仅可以从经ＴＩＲ提取纯化后的ＤＮＡ模板中扩增出目的核酸片段，亦能从未经核酸提取纯化顸处理的菌液中扩增出目的核酸片段。讨论一、ＰＣＲ反应添加剂的选择在本部分实验中，我们选择了ＤＭＳＯ和ｂｅｔａｉｎｅ为主要的ＰＣＲ反应添加剂，主要基于如下考虑：ＰＣＲ反应常受模板中ＧＣ含量较高序列的影响而提前终止，因而降低目的产物产量或扩增的特异性，有时甚至根本就不能进行有效扩增【”】。现已经开发出许多低分子量物质，作茭ＪＰＣＲ反应添加剂（ＰＣＲａｄｄｉｔｉｖｅｓ）来帮助扩增，常用的有：ＤＭＳＯ，甘油，甲酰胺，硫酸铵，海藻糖，ＢＳＡ和ｂｅｔａｉｎｅ等［１５－２７１。使用这些添加剂主要目的是提高扩增的特异性，增进检测的灵敏性，增强酶活性。ＤＭＳＯ：改善ＧＣ含量高的ＤＮＡ的变性情况，使聚合酶更容易在二级结构区延伸，但是当浓度大于１０％时会降低保真性；甘油：提高产量，增加酶的稳定性：甲酰胺：促进某些引物一模板退火，降低带有二级结构的ＤＮＡ的变性温度；硫酸铵：增加反应体系的离子强度，改变ＤＮＡ的变性及退火温度，调节酶活性；ＢＳＡ：增强酶活性；海藻糖：增强酶活性；ｂｅｔａｉｎｅ：通过降低引物一模板错配的稳定性而提高ＰＣＲ产物特异性；帮助去除二级结构使延伸进行得更ＩｒＯＮ等。ＤＭＳＯ和ｂｅｔａｉｎｅ是应用最广泛的两种ＰｃＲ反应添加剂【２７】。二、直接ＰＣＲ扩增体系的初步设立及检验１．直接ＰＣＲ扩增体系的初步设立在本研究中，我们在选定ＤＭＳＯ和ｂｅｔａｉｎｅ这两种最常用的ＰＣＲ反应添加剂基础上，综合国内外相关文献所推荐的使用浓度，ＤＭＳＯ为ｍ％［ｖ／ｖ］口“，ｂｅｔａｉｎｅ为１．１．３Ｍ／２５‘２６１２７１。我们根据此推荐使用浓度，改变Ｍ９２＋浓度或ＰＣＲ反应添加剂，初步设立了三组共计３×１０＝３０种不同的２×ＰＣＲ反应缓冲液为反应缓冲液（见表１．３）。２．初步设立的直接ＰＣＲ扩增体系的扩增效果检验研究结果发现，以经ＤＮＡ提取纯化后带有ｐＵＣｌ８质粒的ＤＨ５Ｑ菌株的ＤＮＡ为模板，使用ｐｕｃｌ８（Ｌ０８７５２）引物组、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＥ００５１７７）引物组和１６ｓＲＮＡ（ＡＥ００５１７７）引物组等三组引物，ＤＭＳＯ组、ｂｅｔａｉｎｅ组和ＭｇＣｌ２组等三组２×ＰＣＲ反应缓冲液均能良第三军医大学硕士学位论文好扩增目的核酸片段。这表明，作为最常用的两类ＰＣＲ反应添加剂，对ＰＣＲ反应均无不良影响。以未经ＤＮＡ提取纯化的带有ｐＵＣｌ８质粒的ＤＨ５ｎ菌株的菌液为模板，使用ｐＵＣｌ８（Ｌ０８７５２）弓ｉ物组、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＥ００５１７７）引物组和１６ｓＲＮＡ（ＡＥ００５１７７）弓］物组等三组引物，ｂｅｌａｉｎｅ组和ＭｇＣｌ２组均能良好扩增目的核酸片段，而ＤＭＳＯ组对三组引物均无法扩增。这表明，ｂｅｔａｉｎｅ确能帮助直接以菌液为模板的ＰＣＲ扩增，可适用于直接ＰＣＲ扩增体系；而ＤＭＳＯ几乎不能协助直接以菌液为模板的ＰＣＲ扩增，几乎没有必要应用于直接ＰＣＲ扩增体系中，或许和其他ＰＣＲ反应添加剂混用可能有一定程度的帮助（未尝试）。直径ＩｍｍＩｊ勺大肠杆菌单菌落约含有１０６。７个细菌㈣，溶解于ｌＯ耻１三蒸水中，每５０ｕ１或４０ｕｌ的反应体系中模板量取ｌｕ１，仍含有１０５－６个拷贝。在本次实验中，ＭｇＣｌ２和ｂｅｔａｉｎｅ在２×ＰＣＲ反应缓冲液中含量中的改变，对扩增结果均无明显影响，或许是所采用的菌液模板中，模板拷贝数高所致。三、直接ＰＣＲ扩增体系的建立１．直接ＰＣＲ扩增体系的设定：在初步设立的ＰＣＲ扩增体系中，我们采用的ＤＮＡ聚合酶是美［］Ｐｒｏｍｅｇａ公司生产的ＴａｇＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ，该酶非国产，且不具备高保真性。目前，国ｌ勾ＤＮＡ聚合酶研究开发进展迅速，已经有多个单位生产的ＤＮＡ聚合酶达到国际一流水平，如复旦大学遗传学研究所、华美公司、中国医学科学院、北京天为时代等等【２扎３０］。如果志在开发加强国防建设的现场生物战剂快速检测装置，为了适应战时等特殊条件下的需要，我们要求该直接ＰＣＲ扩增体系组成成份所需试剂尽量国产化。因此，我们选择了北京天为时代生产的Ｔａｇ酶。ＰｌｕｓＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ为我们直接ＰＣＲ扩增体系所采用的ＤＮＡ聚合结合初步设立的直接ＰＣＲ扩增体系及其扩增效果检验，我们在综合ｂｅｔａｉｎｅ组和ＭｇＣｌ２组中ｂｅｔａｉｎｅ和Ｍｇｃｌ２用量的基础上建立了直接ＰＣＲ扩增体系的１０种直接ＰＣＲ扩增体系，并依次编号为１．１０号。ＰＣＲ反应缓冲液中所采用的成份为：ｂｅｔａｉｎｅ（６Ｍ）、ＴａｇＤＮＡＰｌｕｓＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（北京天为时代）所带含有ＭｇＣｌ２的１０×ＰＣＲ反应缓冲液、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）、ｄＮＴＰｓ（１０ｒａＭｅａｃｈ）。１０种直接ＰＣＲ扩增体系的区别在于所添加的ｂｅｔａｉｎｅ芹Ｉ］ＭｇＣｌ２的量不同，以便适应不同类型目的核酸片段的扩增。