第三军医大学硕士学位论文（８）１，５％琼脂糖凝胶（２００ｍ１）：５０ｘＴＡＥ４ｍｌ，琼脂糖３９，１０ｍｇ／ｍｌ溴化乙锭１０ｕｌ，以三蒸水定容到２００ｍｌ。二、细菌培养及相关准备工作：（１）带有ｐＵＣｌ８质粒的ＤＨ５Ⅱ菌株划线于含氨苄青霉素的ＬＢ琼脂板上，３７。Ｃ培养过夜。（２１在超净工作台上，以接种针分别挑取１０个单菌落溶于含５０ｕｌ三蒸水的两个ＥＰ管中，置４＂Ｃ保存，标记为Ａ，备后续ＤＮＡ提纯使用。（３１在超净工作台上，以接种针分别挑取１个单菌落溶于含１０ｕ１三蒸水的２０个ＥＰ管中，置４＂Ｃ保存，标记为Ｂ，备后续直接ＰＣＲ使用。（４）细菌总ＤＮＡ提取实验步骤１）．取出标记为Ａ，各ＤＮＡ提纯的两个１．５ｍｌＥＰ管，每管加ＴＩＲＯ．８ｍｌ，２５℃的环境中孵育８ｍｉｎ，使ＴＩＲ裂解液充分作用。２、．每管加氯仿１５０ｕ１，盖紧盖子，剧烈震荡１５ｓ，２５。Ｃ的环境中放置１０ｒａｉｎ。３）．高速离心机中离，已，（１２０００ｒｐｍ，１５ｒａｉｎ）。此时可见液体分层：底层——红色酚氯仿相；中间层——白色膜状界面相：上层——无色液相，小心吸除上层无色相。４１．每管加无水乙醇２５０ｌａｌ，盖紧盖子，颠倒混匀，２５＂Ｃ的环境中放置３ｍｉｆｌ。５１．高速离心机中离一巳，（２０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ），此时可见管底白色沉淀，弃上清（动作轻，慢１，管底白色沉淀即为ＤＮＡ。６１．每管以１０％乙醇溶解的Ｏ．１Ｍ柠檬酸钠ｌｍｌ冲洗沉淀，２５℃的环境中放置３０ｍｉｎ，问或弹指法震荡。７）．高速离心机中离－Ｄ（２０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ），弃上清（动作轻，慢）。８１．重复步骤６、７冲洗沉淀，共记冲洗３次。９）．以７５％乙醇溶液１．５ｍｌ冲洗沉淀，２５℃的环境中放置２０ｍｉｎ。１０）．高速离心机中离一ｔｊ，（２０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ），弃上清（动作轻，慢），通风干燥沉淀１０分钟，让乙醇挥发。１１１，每管以２０ｕｌ三蒸水溶解，作为后续实验中的经ＤＮＡ提取纯化组ＰＣＲ模板，置．２０℃保存备用。ｆ５、引物设计登录Ｇｅｎｅｂａｎｋ，查询细菌Ｅ．ｃｏｌｉ．基因组全长序歹ＩＪ（ＡＥ００５１７７），ｐＵＣｌ８质粒全长序列（Ｌ０８７５２），采用ＰｒｉｍｉｅｒＰｒｉｍｉｅｒ５，０引物设计软件设计引物序列，引物设计时注意避免发夹结构、引物二聚体、引物间二聚体、分子内非特异扩增等不良情形的出现，再第三军医大学硕士学位论文经联网Ｂｌａｓｔ排除对Ｅ．ｃｏｌｉ．的分子间非特异扩增情形的发生，引物由中国上海生公合成，每条引物合成两个ＯＤ。细菌１６ＳＲＮＡ引物由本校分子遗传学教研室惠赠。引物序列：ｐＵＣＩ８ｆＬ０８７５２）４Ｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ：５７ＡＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧＧ３’ＧＧＣＡＧＧＧＴＣＧＧＡＡＣＡＧＧＡＧＡ３Ａｎｔｉｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ：５Ｐｒｏｄｕｃｔ：３４７ｂｐＴａ：５７．９℃Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＥ００５１７７）Ｓｅｎｃｅｐｒｉｍｅｒ：５ＡＴＣＡＡＣＣＧＣＡＧＧＡＴＧＣＣＡＣＡＡＣＧＡＡＣＡＧＣＡＧＧＧＴＣＡＧＧＴＴＡＣＡＧＡｎｔｉｓｅｎｃｅｐｒｉｍｅｒ：５Ｐｒｏｄｕｃｔ：３９８ｂｐＴａ：５４．６℃１６ｓＲＮＡ（ａｅ００５１７７）Ｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ：Ｐｒｏｄｕｃｔ：１４８４ｂｐ５’ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ５７３７７ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣ３Ｔａ：５５．４℃（＋注：ｐＵＣｌ８为引物标识，ＡＥ００５１７７为引物设计时所选用序列在Ｇｅｎｅｂａｎｋ中对应的序列号，ｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ为上游引物或正义引物，ａｎｔｉｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ为下游引物或反义引物，ｐｒｏｄｕｃｔ为目的核酸片段长度，Ｔａ为进行引物设计或引物分析时软件推荐的退火温度。）（６）引物稀释所订购引物经核对序列无误后，高速离心机上短暂离心，小心打开，每管ａｎ＝蒸水２００川溶解，浓度约为２５ｕＭ，在５０ｕｌ的ＰＣＲ反应体系中，每次用１终浓度为Ｏ．５ｕＢ１，引物Ｍ，盖紧盖子，剧烈震荡混匀，置．２０℃保存备用。（７）直接ＰＣＲ扩增体系的初步设立以不同的ＰＣＲ添加剂，分为ＤＭＳＯ组、ｂｅｔｍｎｅ组和ＭｇＣｌ２组，共三组。因ＤＭＳＯ的文献推荐使用浓度为１０％（ｖ／ｖ）【２６】，故ＤＭＳＯ组为固定ＤＭＳＯ的用量，改变ＭｇＣｌ２的用量；ｂｅｔａｉｎｅ的文献推荐使用浓度为１—１．３Ｍｆ２５、２６’２７１，ｂｅｔａｉｎｅ组为固定ｂｅｔａｉｎｅ的用量，改变ＭｇＣｌ２的用量；而ＭｇＣｌ２组为固定ＭｇＣｌ２的用量，改变ｂｅｔａｉｎｅ的用量；１２第三军医大学硕士学位论文每组再根据所添加试剂的量的不同分为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｏ、Ｈ、Ｉ、Ｊ共１０种。以ＴａｇＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、美国）所配带１０×Ｂ类ｂｕｆｆｅｒ，ＭｇＣｌ２（２５ｒａＭ），ｂｅｔａｉｎｅ（６Ｍ），ＤＭＳＯ（超纯），４ＸｄＮＴＰｍｉｘ（１０ｒａｍｅａｃｈ），三蒸水等配制成为供ＴａｇＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、美国）进行ＰＣＲ反应的２Ｘ反应缓冲液，如下表所示（表１．３）：表１ＤＭＳＯ组２×ＰＣＲ反应缓冲液（单位为ｕ１）ＤＭＳＯ组ＡＢＣＤＥＦＧＨＩＪＤＭＳＯ２０２０２０２０２０２０２０２０２０２０１０Ｘｂｕｆｆｅｒ２０２０２０２０２０２０２０２０２０２０ＭｇＣｌ２１０１２１４１６１８２０２２２４２６２８ｄＮＴＰｓ４４４４４４４４４４三蒸水４６４４４２４０３８３６３４３２３０２８合计１００１００１００１００１００１００１００１００１００１００表２ＭｇＣｌ２组２×ＰＣＲ反应缓冲液（单位为ｕ１）Ｂｅｔａｉｎｅ组ＡＢＣＤＥＦＧＨＩＪｂｅｔａｉｎｅ３４３６３８４０４２４４４６４８５０５２１０×ｂｕｆｆｅｒ２０２０２０２０２０２０２０２０２０２０ＭｇＣｌ２】９１９１９】９１９１９１９１９】９１９ｄＮＴＰｓ４４４４４４４４４４三蒸水２３２１１９１７１５１３１１９７５合计１００１００１００１００１００１００１００１００１００１００表３ｂｅｔａｉｎｅ组２ＸＰＣＲ反应缓冲液（单位为“】）ＭｇＣｌ２组ＡＢＣＤＥＦＧＨＩＪｂｅｔａｉｎｅ４４４４４４４４４４４４４４４４４４４４１０×ｂｕｆｆｅｒ２０２０２０２０２０２０２０２０２０２０ＭｇＣｌ２ｌＯ１２ｔ４１６１８２０２２２４２６２８ｄＮＴＰｓ４４４４４４４４４４三蒸水２２２０１８１６１４１２１０８６４合计１００１００１００１００１００１００１００１００１００１００３第三军医大学硕士学位论文２×反应缓冲液配制完毕，置．２０℃保存备用。三、实验分组设置：１．根据ＰＣＲ反应中所采用的模板不同分为如下三组：预处理组：采用经ＴＩＲ提取纯化的ＤＮＡ为ＰＣＲ反应模板，每次反应用量１ｐ】。直接ＰＣＲ组：采用前述以１０ｕｌ三蒸水溶解的单菌落菌液为ＰＣＲ反应模板，每次反应用量ｌｕ１。阴性对照组：以ｌｕ１三蒸水代替提取纯化的ＤＮＡ或菌液。２．根据ＰＣＲ反应中所采用的反应缓冲液不同分为如下两组：１０×Ｂ类ＰＣＲ反应缓冲液组和２×ＰＣＲ反应缓冲液组。２ＸＰＣＲ反应缓冲液组又根据２ＸＰＣＲ反应缓冲液成份不同分为ＤＭＳＯ组、ｂｅｔａｉｎｅ组和ＭｇＣｌ２组共三组（如表１、２、３所示），每组又根据表１．３中所列情形分为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ共１０种。３．根据所扩增对象所采用的引物不同分为如下三组：ｐＵＣｌ８（Ｌ０８７５２）弓１物组、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＥ００５１７７）引物组和１６ｓＲＮＡ（ＡＥ００５１７７）］Ｉ物组。四、反应体系及循环步骤１．据所采用的缓冲液不同，共分两种两种体系：１０×Ｂ类ＰＣＲ反应缓冲液组反应体系和２×ＰＣＲ反应缓冲液组反应体系。如下表所示：表４ＰＣＲ反应体系（单位为ｕ１）４