直接PCR扩增体系的建立与应用性研究 - 图文

第三军医大学硕士学位论文(8)1,5%琼脂糖凝胶(200m1):50xTAE4ml,琼脂糖39,10mg/ml溴化乙锭10ul,以三蒸水定容到200ml。二、细菌培养及相关准备工作:(1)带有pUCl8质粒的DH5Ⅱ菌株划线于含氨苄青霉素的LB琼脂板上,37。C培养过夜。(21在超净工作台上,以接种针分别挑取10个单菌落溶于含50ul三蒸水的两个EP管中,置4"C保存,标记为A,备后续DNA提纯使用。(31在超净工作台上,以接种针分别挑取1个单菌落溶于含10u1三蒸水的20个EP管中,置4"C保存,标记为B,备后续直接PCR使用。(4)细菌总DNA提取实验步骤1).取出标记为A,各DNA提纯的两个1.5mlEP管,每管加TIRO.8ml,25℃的环境中孵育8min,使TIR裂解液充分作用。2、.每管加氯仿150u1,盖紧盖子,剧烈震荡15s,25。C的环境中放置10rain。3).高速离心机中离,已,(12000rpm,15rain)。此时可见液体分层:底层——红色酚氯仿相;中间层——白色膜状界面相:上层——无色液相,小心吸除上层无色相。41.每管加无水乙醇250lal,盖紧盖子,颠倒混匀,25"C的环境中放置3mifl。51.高速离心机中离一巳,(2000rpm,5min),此时可见管底白色沉淀,弃上清(动作轻,慢1,管底白色沉淀即为DNA。61.每管以10%乙醇溶解的O.1M柠檬酸钠lml冲洗沉淀,25℃的环境中放置30min,问或弹指法震荡。7).高速离心机中离-D(2000rpm,5min),弃上清(动作轻,慢)。81.重复步骤6、7冲洗沉淀,共记冲洗3次。9).以75%乙醇溶液1.5ml冲洗沉淀,25℃的环境中放置20min。10).高速离心机中离一tj,(2000rpm,5min),弃上清(动作轻,慢),通风干燥沉淀10分钟,让乙醇挥发。111,每管以20ul三蒸水溶解,作为后续实验中的经DNA提取纯化组PCR模板,置.20℃保存备用。f5、引物设计登录Genebank,查询细菌E.coli.基因组全长序歹IJ(AE005177),pUCl8质粒全长序列(L08752),采用PrimierPrimier5,0引物设计软件设计引物序列,引物设计时注意避免发夹结构、引物二聚体、引物间二聚体、分子内非特异扩增等不良情形的出现,再第三军医大学硕士学位论文经联网Blast排除对E.coli.的分子间非特异扩增情形的发生,引物由中国上海生公合成,每条引物合成两个OD。细菌16SRNA引物由本校分子遗传学教研室惠赠。引物序列:pUCI8fL08752)4Senseprimer:57AGAGGCGGTTTGCGTATTGG3’GGCAGGGTCGGAACAGGAGA3Antisenseprimer:5Product:347bpTa:57.9℃E.coli(AE005177)Senceprimer:5ATCAACCGCAGGATGCCACAACGAACAGCAGGGTCAGGTTACAGAntisenceprimer:5Product:398bpTa:54.6℃16sRNA(ae005177)Senseprimer:Antisenseprimer:Product:1484bp5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG57377AAGGAGGTGATCCAGCC3Ta:55.4℃(+注:pUCl8为引物标识,AE005177为引物设计时所选用序列在Genebank中对应的序列号,senseprimer为上游引物或正义引物,antisenseprimer为下游引物或反义引物,product为目的核酸片段长度,Ta为进行引物设计或引物分析时软件推荐的退火温度。)(6)引物稀释所订购引物经核对序列无误后,高速离心机上短暂离心,小心打开,每管an=蒸水200川溶解,浓度约为25uM,在50ul的PCR反应体系中,每次用1终浓度为O.5uB1,引物M,盖紧盖子,剧烈震荡混匀,置.20℃保存备用。(7)直接PCR扩增体系的初步设立以不同的PCR添加剂,分为DMSO组、betmne组和MgCl2组,共三组。因DMSO的文献推荐使用浓度为10%(v/v)【26】,故DMSO组为固定DMSO的用量,改变MgCl2的用量;betaine的文献推荐使用浓度

>>展开全文<<
12@gma联系客服:779662525#qq.com(#替换为@)