药材中总黄酮的含量，避免其他非黄酮成分对测定准确度的影响。
三．仪器与试药
紫外—可见分光光度计，三用紫外分析仪，索氏提取器，槐花药材，芦丁对照品，三氯化铝试液，5%亚硝酸钠溶液，10%硝酸铝溶液，氢氧化钠试液，甲醇，乙酸乙酯，甲酸，乙醚。 四．实验步骤 1.薄层色谱鉴别
（1）供试品溶液的制备，取槐花粉末0.2g，置于具塞试管中，加甲醇5ml，密塞，振摇10分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液。
（2）对照品溶液的制备：取芦丁对照品适量，加甲醇制成浓度为4mg/ml的溶液，作为对照品溶液。 （3）测定法：吸取两种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯—甲酸-水（8:1:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，待溶液挥干后，置紫外光灯（365nm）下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的颜色的荧光斑点。 2.总黄酮含量测定
（1）对照品溶液的制备：取芦丁对照品50mg，精密称定，置于25ml量瓶中，加甲醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取10ml,置于100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得浓度为0.2mg/ml的芦丁对照品溶液。
（2）标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1ml,2ml,3ml,4ml,5ml与6ml，分别置于6个25ml量瓶中，各加水使成6.0ml，精密加5%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，再加10%硝酸铝溶液1.0ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠溶液10.0ml，加水稀释至刻度，摇匀，放置15分钟，不加对照品溶液同法配制空白溶液，按照紫外可见分光光度法，在500nm波长处测定各溶液的吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（3）测定法：将槐花粉碎，取槐花粗粉约1g，精密称定，置于索氏提取器中，加乙醚120ml，水浴加热回流至乙醚提取液无色，放冷，弃去乙醚提取液。提取器中再加入甲醇90ml，加热回流至甲醇提取液无色，将提取液置于100ml量瓶中，用少量甲醇洗涤索氏提取器，洗液并入上述100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液10ml，置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取上述溶液10ml，置于100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液3ml，置25ml量瓶中，按照标准曲线制备项下的方法，自“加水使成6.0ml”起，同法测定吸光度，由标准曲线计算出供试品溶液中芦丁的重量（ug）,即得。
槐花按干燥品计算，含总黄酮以芦丁（C27H30O16）计，槐花不得少于8.0%，槐米不得少于20.0%。
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五．注意事项
1.使用乙醚时，注意实验室不得有明火。
2.比色法中显色反应及条件对形成的稳定配位化合物有一定影响，因此实验中需要遵守平行操作原则：如配置标准系列溶液时，空白与标准系列溶液中加入各种反应试剂的量、顺序、反应时间与温度等操作步骤均应保持平行；所有加入的反应试剂均应使用刻度吸管精密量取，准确加入。
3. 注意吸收池（比色皿）的配对使用。
4. 进行含量测定时，洗涤索氏提取器的甲醇量需控制。 六 、 思考题
1. 槐花含量测定法中，为何先用乙醚回流提取并将提取液弃去？ 2. 简述比色法测定槐花药材中总黄酮含量的基本原理。 七、 附录
1. 比色法的基本原理与测定方法 待测定样品本身在紫外-可见光区没有强吸收，或在紫外光区虽有吸收，但为了排除干扰、增加选择性或提高测定的灵敏度，可加入适当的显色剂，是待测样品与显色剂的反应产物的最大吸收波长移至可见光区，这种测定方法称为比色法。这种分析法可以用于药物的定性、定量测定。
用比色法测定时，由于显色时有很多因素会影响显色的深浅，所以供试品与对照品或标准品应遵循平行操作原则。在规定的波长处测定对对照品和供试品溶液的吸光度后，按照紫外分光光度法项下对照品比较法来计算供试品浓度。
当吸光度和浓度关系不呈线性时，应取数份浓度呈梯度的对照品溶液，用溶剂补充至同一体积，加入显色剂显色后测定各份溶液的吸光度，然后以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，再根据供试品的吸光度在标准曲线上查得其相应浓度，并求出其含量。 2. 实验试液配制
（1）三氯化铝试液：取三氯化铝1g，加入乙醇使溶解成100ml，即得。 （2）5%亚硝酸钠溶液：取2.5g亚硝酸钠，加水溶解成50ml，摇匀即得。 （3）10%硝酸铝溶液：取5.0g硝酸铝，加水溶解成50ml，摇匀即得。 （4）氢氧化钠试液：取氢氧化钠4.3g，加水溶解成100ml，即得。
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实验九 维生素C制剂分析的综合设计性实验
【实验目的】
1、掌握碘量法的原理和操作方法。
2、掌握常用辅料对制剂含量测定的影响和排除方法。 3、掌握制剂的含量计算方法 【实验原理】
维生素C分子中的烯二醇基具有还原性，能被I2定量地氧化成二酮基：
1分子维生素C与2摩尔I相当（中国药典规定，1个I为1摩尔），所以维生素C的滴定当量等于分子量的1/2。 【实验材料】
试药：维生素C片，维生素C注射液。
仪器：25mL棕色滴定管，50mL移液管，刻度吸管，碘量瓶，100mL量瓶。 【实验内容】
（一）维生素C片（Vitamin C Tablets）
本品为白色或略带淡黄色片，含维生素C（C6H8O6）应为标示量的93.0%~107.0%
[含量测定]取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于维生素C 0.2g），置100mL量瓶中，加新沸过的冷水100mL与稀醋酸10mL的混合液适量，振摇使维生素C溶解并稀释至刻度，摇匀，
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经干燥滤纸迅速滤过，精密量取续滤液50mL，加淀粉指示液1mL，用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液显蓝色并持续30秒钟不褪。每1mL碘滴定液（0.1mol/L）相当于8.806mg的C6H8O6。
（二）维生素C注射液（Vitamin C Injection）
本品为维生素C的灭菌水溶液，无色或微黄色的澄明液体。含维生素C（C6H8O6）应为标示量的90.0%~110.0%。本品中可加适量的焦亚硫酸钠为稳定剂。
[含量测定]精密量取本品适量（约相当于维生素C 0.2g），加水15mL与丙酮2mL，摇匀，放置5分钟，加稀醋酸4mL与淀粉指示液1mL，用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液显蓝色并持续30秒钟不褪。每1mL碘滴定液（0.1mol/L）相当于8.806mg的C6H8O6。 【实验说明】
维生素C在空气中易被氧化，过滤、滴定等操作应迅速。
实验十 双波长分光光度法测定复方制剂含量
【实验目的】
1、掌握双波长分光光度法消除干扰的原理和波长选择原则。 2、掌握紫外-标准对照法测定药物含量及计算方法。 3、熟悉紫外分光光度仪的构造和使用操作。 【实验原理】
复方磺胺嘧啶片系由磺胺嘧啶和甲氧苄啶组成的复方制剂。两者在紫外区有较强的吸收。在盐酸溶液（9→1000）中，磺胺嘧啶在308nm处有吸收，而甲氧苄啶在此波长处无吸收，故可在此波长处直接测定磺胺嘧啶的吸收度而求得含量。甲氧苄啶在277.4nm波长处有较大吸收，而磺胺嘧啶在277.4nm处与308nm处有等吸收点。故可采用双波长法以277.4nm为测定波长，308nm为参比波长，测定甲氧苄啶在该两波长处的ΔA（ΔA=A277nm-A308nm）值来计算含量。
复方氨基比林注射液又称安痛定注射液，系氨基比林、安替比林和巴比妥组成的复方制剂，采用双波长分光光度法测定安替比林的含量。根据巴比妥在酸性溶液中不呈解离状态，而无明显紫外吸收；安替比林在233nm处有较强的吸收；氨基比林在233nm和268nm处有等吸收，选择安替比林的吸收峰波长233nm为测定波长λ1，氨基比林的等吸收波长268nm为参比波长λ2，则△A =A233nm-A268nm只与安替比林的浓度有关，而巴比妥、氨基比林及其他辅料不干扰测定。 【实验材料】
试药：磺胺嘧啶对照品，甲氧苄啶对照品，复方磺胺嘧啶片，安替比林对照品，安痛定注射液。 仪器：紫外分光光度仪，石英比色皿，100mL容量瓶，移液管。 【实验内容】
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