学存在操作失误或培养基的配制有问题。另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。 P24旁栏思考题
为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？
这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。 P25 结果分析与评价
1．培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落
对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。
2．样品的稀释操作是否成功
如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。
3．重复组的结果是否一致
如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，教师需要引导学生一起分析产生差异的原因。 P26练习
2.提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基外，还应参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
进行定量测定。
P28旁栏思考题
1.本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？
本实验流程与课题2的流程的区别如下。课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为惟一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。
2.为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？
由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。
3.将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？
将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10 cm左右腐殖土壤中。 P29旁栏思考题
1．想一想，这两种方法各有哪些优点与不足？你打算选用哪一种方法？（两种刚果红染色法的比较）
方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。
方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。
2.为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？
在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。 P29六、课题成果评价
生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。
2.分离的结果是否一致：由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。 P30练习
土壤取样→选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）→梯度稀释→将菌悬液涂布到有特定选择作用的培养基上→挑选单菌落→发酵培养
课题3 分解纤维素的微生物的分离
1．纤维素是 类物质， 是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。
和 ，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成 。正是在这三种酶的协同作用下，纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养，同样，也可以为人类所利用。
3．筛选纤维素分解菌可以用 法，这种方法能够通过 直接对微生物进和 发生这种反应。纤维素分解菌能产生 分解纤维素，从而使菌落周围形成 。 → 。
5．为确定得到的菌是否是纤维素分解菌，还学进行 的实验。纤维素酶的发酵2．纤维素酶是一种 酶，一般认为它至少包括三种组分，即 、 1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落：对照的培养基在培养过程中没有菌落
行筛选。 可以与像纤维素这样的多糖物质形成 ，但并不和水解后的 2. 答：流程图表示如下。
4．分离分解纤维素的微生物的实验流程图如下： → →梯度稀释→
方法有 发酵和 发酵。测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的
5
专题知识归纳
培养基
培养基的类型 培养基的营养物质
无菌技术 避免杂菌污染的方法
实验室常用的消毒方法
实验室常用的灭菌方法
微
计算 生 称量
物 制备牛肉膏蛋白 的 胨固体培养基 溶化 灭菌
实 倒平板 验 室 纯化大肠杆菌 平板划线法
称释涂布法 培 结果分析与评价 养 课题延伸
微 生 PCR技术
筛选菌株 实验室中筛选微生物的原理 物 土壤 选择培养基 中分 统计菌落数目 稀释涂布平板法 的 显微镜直接计数法 培 解尿 设置对照 设置对照的目的 对照实验的概念 养 素的 土壤取样 与 细菌 实验设计
样品的稀释
微生物的培养与观应 的分 察无菌操作 做好标记 用
离与 操作提示 规划时间结果分析与评价
计数
课题延伸
纤维素与纤维素酶
纤维素酶的组成成分
纤维素酶分解纤维素的实验 刚果红染料
分解 纤维素分解菌的筛选 筛选纤维素分解菌的依据 纤维素 土壤取样 实验设计 选择培养 的微生 刚果红染色法 物的 操作提示 复习微生物技术 选择培养的操作方法
分离
结果分析与评价
课题延伸
专题三 植物的组织培养技术
课题1 菊花的组织培养
1．有某种生物全套 的任何一个活细胞，都具有发育成 的能力，即每个生物细胞都具有 。但在生物体的生长发育过程中并不表现出来，这是因为在 条件下，通过基因的 ，构成不同组织和器官。
2. 植物组织培养技术的应用有：实现优良品种的 ；培育 作物；制作 种子；培育作物 以及细胞产物的 等。
3. 细胞分化：个体发育中细胞在 上出现 差异的过程。
4. 愈伤组织是通过 形成的，其细胞排列 ，高度 呈 状态的 细胞。 5. 植物组织培养的过程可简单表示为：
（脱分化））（生长）
愈伤组织 （ ） 新个体 6.材料：植物的种类、材料的 和 等都会影响实验结果。菊花组织培养一般 选择 作材料。
7. 营养：常用的培养基是 培养基，其中含有的大量元素是 ，微量元素是 ，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。 8.激素：在培养基中需要添加 和 等植物激素，其 、 、
等都影响结果。
9.环境条件：PH、 、 等环境条件。菊花组培所需PH为 ，温度为 ，光照条件为 。
10. 配制各种母液：将各种成分按配方比例配制成的浓缩液。使用时根据母液的 ，计算用量，并加 稀释。
11. 配制培养基：应加入的物质有琼脂、 、大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，并用 定容到 毫升。在菊花组织培养中，可以不添加 ，原因是菊花茎段组织培养比较容易。
12.灭菌：采取的灭菌方法是 。 13．发酵操作
13.1前期准备：用 消毒工作台，点燃酒精灯。注意所有接种工作都必须在酒精灯旁进行，器械使用前后都要用火焰灼烧 。
13.2接种操作：接种过程中插入外植体时 朝上，每个锥形瓶接种 个外植体。外植体接种与细菌接种相似之处是 。
13.3培养过程应该放在 中进行，并定期进行消毒，保持适宜的 和 。 13.4移栽前应先打开培养瓶的 ，让其在培养间生长几日，然后用流水清洗根部培养基。然后将幼苗移植到 等环境中生活一段时间，进行壮苗。最后进行露天栽培。
课题成果评价
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（一）对接种操作中污染情况的分析
接种3～4 d后，在接种操作中被杂菌污染的培养物会表现出被污染的现象。请学生适时统计污染率，分析接种操作是否符合无菌要求。
（二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化
观察实验结果，看看是否培养出了愈伤组织，记录多长时间长出愈伤组织。统计更换培养基后愈伤组织进一步分化成根和芽的比例和时间。
（三）是否进行了统计、对照与记录
做好统计和对照，填好结果记录表，培养严谨的科学态度。从实验的第一步开始就要求学生做好实验记录，可以让学生分组配制不同培养基，如诱导愈伤或直接分化丛芽的培养基，然后做不同配方的比较。
（四）生根苗的移栽是否合格
生根苗移栽技术的关键是既要充分清洗根系表面的培养基，又不能伤及根系。一般使用无土栽培的办法。培养基质要提前消毒，可以向培养基质喷洒质量分数为5%的高锰酸钾，并用塑料薄膜覆盖12 h。掀开塑料薄膜后24 h才能移栽。新移栽的组培苗要在温室过渡几天，等壮苗后再定植大田或进行盆栽。学生可以在课后统计自己移栽的成活率，看看移栽是否合格。
答案和提示 （一）旁栏思考题
1.你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？
答：微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。
2.你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？
答：教师可以安排学生分组，做不同的材料或配方，最后分别汇报成果。但每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。
（二）练习
1.答：植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，对培养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长。而培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。
2.答：外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件之一。生长旺盛的嫩枝生理状况好，容易诱导脱分化和再分化。
7
课题2 月季的花药培养
1.
2. 育被子植物花粉的发育要经历 、 和 等阶段。花粉是由花粉母细胞经
过 而形成的，因此花粉是 。
3. 在正常情况下，一个小孢子母细胞可以产生 个精子；在一枚花药中可以产生 个花粉。 4. 产生花粉植物的两种途径 ①
花药中的花粉 脱分化 单核（ ）期（n） 单核（ ）期（n） （ ）细胞核（n） （ ）细胞核（n） （ ）分裂 双核期 小孢子母细胞（2n） （ ）分裂 （ ）时期（n） （ ）个精子(n) （ ）分裂 （ ）细胞（n） （ ）细胞（n） （ ） 丛芽 诱导 生根 移栽
脱分化 （ ） ② 花药中的花粉 丛芽
5. 诱导花粉植株能否成功及诱导成功率的高低，受多种因素影响，其中影主要因素是：
和 等。 6. 材料的选择：
①从花药来看，应当选择（初花期、盛花期、晚花期）的花药；
②从花粉来看，应当选择（四分体期、单核期、双核期、萌发期）的花粉； ③从花蕾来看，应当选择（完全未开放、略微开放、完全盛开）的花蕾。
7. 选择花药时一般通过 确定花粉发育时期，此时需要对花粉细胞核进行染色，最常用的染色剂是 和 ，它们分别可以将细胞核染成 色和 色。 按体积比为 的比例混合均匀。
9. 消毒后的花蕾，要在 条件下除去花萼、花瓣。剥取花药时，一是注意不要损伤花药，原因是 ；二是要彻底除去花丝，原因是 。
10. 剥取的花药要立刻接种到 上。每个培养瓶接种 个花药。花药培养利用的培养基是 培养基，pH为 ，温度为 ℃，幼苗形成之前（需要、不需要）光照。在花药培养基中，用量最高的激素是 ；在诱导丛芽或胚状体培养基中，用量最高的激素是 ；在诱导生根的培养基中，用量最高的激素是 。
11. 培养20－30d后，花药开裂，长出 或释放出胚状体。前者还要转移到 上进行分化培养成再生植株；后者要尽快 并转移到新的培养基上。通过愈伤组织形成的植株，常常会出现 的变化，因而需要鉴定和筛选。
8. 在使用焙花青－铬钒溶液时，需要首先将花药用 处理20min。该试剂的配制方法是将
课题成果评价 （一）选材是否恰当
选材是否成功是花药培养成功的关键。学生应学会通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。 （二）无菌技术是否过关
如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。 （三）接种是否成功
如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。
答案和提示 （一）旁栏思考题
为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？
答：花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，给材料的消毒带来困难。 （二）练习
1.答：F2代紫色甜玉米的基因型组成可能为Aasusu或AAsusu。如果运用常规育种方法，将F2代中的紫色甜玉米与白色甜玉米（aasusu）进行测交，可以选择出基因型为AAsusu纯种紫色甜玉米。但这种方法比较繁琐，耗时也较长，需要至少三年的选种和育种时间。如果利用花药培养的技术，在F1代产生的花粉中就可能有Asu的组合，再将花粉植株进行染色体加倍，就可以直接得到紫色甜玉米的纯合体（AAsusu）。这种方法可以大大缩短育种周期。
2.答：植物组织培养技术与花药培养技术的相同之处是：培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。两者的不同之处在于：花药培养的选材非常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾；花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基；花药培养对培养基配方的要求更为严格。这些都使花药培养的难度大为增加。
8
概念： 原理：细胞的全能性
基础： 条件：
脱分化 再分化
菊植物组织培养的基本过程： 外植体 愈伤组织 胚状体 幼苗
花外植体的选择
的组 织影响植物组织培养的因素：
营养、环境等 培养植物激素的用法 植 温度、pH、光照等
物组 织 实验操作： 制备MS培养基
外植体消毒 接种 培养 移栽 栽培
培养 被子植物花粉的发育： 花粉母细胞→减数分裂→小孢子母细胞→四分体时期→
单核期→双核期→精子
月 季产生花粉植株的两种途径： 的
花 花药中的花粉 脱分化 胚状体 分化 丛芽 诱导 药再分化生根 移栽
培 养花药中的花粉 脱分化 愈伤组织 丛芽 主要因素：材料的选择与培养基的组成
影响花药培养的因素： 重要因素：选择合适的花粉发育时期
影响因素：亲本植株的生长条件、低温处理和接
种密度等
材料的选取：确定花粉发育时期的方法
实验操作： 材料的消毒：
接种和培养： 鉴定和筛选：