实验16 酶的特异性和影响酶反应速度的因素
一、目的
1、了解酶的特异性。
2、了解温度、pH值、激活剂和抑制剂等因素对酶反应速度的影响。
3、掌握检查酶的特异性，酶的激活剂和抑制剂影响酶反应速度的方法及原理。 4、学习测定酶最适pH值的方法。 二、原理
酶是生物体中具有催化功能的蛋白质，因此也叫生物催生剂。生物体内存在多种多样的酶，从而使生物体在温和的条件下能迅速完成复杂的生物化学反应。
酶具高度的特异性。所谓特异性是指一种酶能对一种化合物或一类化合物起催化作用，而不能对别的物质发生催化反应。
淀粉和蔗糖无还原性。唾液淀粉酶水解溶粉生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖水解。蔗糖酶能催化蔗糖水解产生还原性的葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉水解，用Benedict试剂检查糖的还原性。
温度和pH对酶的活性有显著的影响，使反应速度达最大反应值时的温度称为某种酶作用的最适温度。大多数动物酶的最适温度为37℃~40℃，植物酶的最适温度为50℃~60℃，能使酶表现其活性最高时的pH值称为该酶的最适pH值，不同酶的最适pH值不同。
酶的活性常受某些物质的影响，能使酶活性增加的物质称为酶的激活剂，能使酶的活性降低的物质称为酶的抑制剂。氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。
三、材料、试剂与器具 （一）材料
1、干酵母 2、黄豆粉 （二）试剂
1、2%蔗糖溶液：蔗糖是典型的非还原糖，若商品蔗糖中还原糖含量超过一定标准，则呈现还原性，这种蔗糖不能使用，所以实验必须进行检查，本实验用的蔗糖至少应是分析纯的试剂。
2、0.3%氯化钠的1%淀粉溶液（新配制）。
3、释释200倍的新鲜唾液（5滴唾液，加蒸馏水稀释至50毫升）。
4、蔗糖酶溶液：取干酵母100克，置于乳钵内，加适量的蒸馏水和少量石英砂，用力研磨提取1小时，再加蒸馏水使总体积约500毫升，过滤，将滤液保存于冰箱备用。
5、本尼迪克特试剂（Benedict）：将硫酸铜17.3克溶于100毫升热蒸馏水中，冷却，稀释至150毫升，取柠檬酸钠173克及无水碳酸钠（Na2CO3）100克，加水600毫升，加热使之溶解，冷后后稀释至850毫升。最后把硫酸铜溶液缓缓倒入柠檬酸钠一碳酸钠溶液中，摇匀，用细口瓶贮存，此试剂可以保存很久。
6、0.1%淀粉溶液。 7、1%氯化钠溶液。 8、1%硫酸铜溶液 9、1%的硫酸钠溶液
10、碘化钾—碘溶液（稀）。
11、0.3%氯化钠0.2%淀粉溶液。 12、1%尿素溶液
13、脲酶提取液：取黄豆粉6克，加30%乙醇250毫升，振荡10分钟，过滤，可保存1~2星期。
14、奈斯勒试剂：称取5克碘化钾，溶于5毫升蒸馏水中，加入饱和氯化汞溶液（100毫升约溶解5.7克氯化汞）并不断搅拌。直至产生的朱红沉淀不再溶解时，再加40毫升50%氢氧化钠溶液，稀释100毫升，混匀，静置过夜，倾出清液于棕色瓶中。
15、0.3%氯化钠的0.5%淀粉溶液（新配制） 16、0.2M磷酸氢二钠溶液 17、0.1M柠檬酸溶液 （三）器具
1、试管及试管架
2、移液管（1，2，5毫升） 3、冰浴 4、恒温水浴 5、白瓷板 6、秒表
四、操作步骤 （一）酶的特异性
1、淀粉酶的特异性实验
取试管6支，编号，按下表进行操作 管号 1%淀粉溶液（滴） 2%蔗糖溶液（滴） 稀释唾液（ml） 煮沸过的稀释唾液（ml） 蒸馏水（ml） 1 4 1 2 4 1 3 4 1 4 4 1 5 4 1 6 4 1 37℃恒温水浴15分钟 Benedicty试剂（ml） 2 2 2 2 2 2 沸水浴2~3分钟 现 象 解释结果 2、蔗糖酶的特异性实验
取试管6支，编号，按下表进行操作 管 号 1%淀粉溶液（滴） 2%蔗糖溶液（滴） 蔗糖酶溶液（ml） 煮沸过的蔗糖酶溶液(ml) 蒸馏水（ml） 1 4 1 2 4 1 3 4 1 4 4 1 5 4 1 6 4 1 37℃恒温水浴15分钟 Benedict 试剂(ml) 2 2 2 2 沸水溶2-3分钟 2 2 现 象 解释结果 （二）酶的激活剂及抑制剂
取试管4支，编号，按下表加入试剂 管 号 0.1%淀粉溶液（ml） 稀释唾液(ml) 1%硫酸铜溶液(ml) 1%氯化钠溶液（ml） 1%硫酸钠溶液(ml) 蒸馏水(ml) 碘化钾——碘溶液（滴） 现象 解释结果 1 2 3 3 3 3 1 1 1 1 1 1 37℃恒温水浴、保温10分钟 2~3 2~3 2~3 4 3 1 1 2~3 说明本实验第3管的意义。
（三）温度对酶活性的影响
1、温度对唾液淀粉酶活性的影响
唾液淀粉酶可将淀粉逐步水解成各种不同大小分子的糊精及麦芽糖。它们遇碘各呈不同的颜色。直链淀粉（即可溶性淀粉）遇碘呈蓝色，糊精按分子从大到小的顺序遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色，最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈颜色。由于不同温度下唾液淀粉酶的活性高低不同，则淀粉被水解的程度不同。所以，可由酶反应混合物遇碘所呈现颜色来判断。
取3支试管，编号后各加0.3%氯化钠的0.2%的淀粉溶液2毫升。将第1、2号试管放入37℃恒温水浴中保温，第3号试管放入冰水中冷却，5分钟后，向第1号试管中加入煮沸5~15分钟的稀释唾液1毫升，向第2，3号试管加稀释唾液各1毫升。摇匀。20分钟后取出3支试管，各加入碘化钾—碘溶液2滴，混匀，比较各管溶液的颜色。判断淀粉被唾液酶水解的程度，并说明温度对唾液酶活性的影响。
2、温度对脲酶活性的影响
脲酶能催化尿素水解生成氨和二氧化碳，氨可以与奈斯勒试剂作用生成红色化合物。由颜色深浅可断定反应进行的程度。
脲酶 NH2 C=O+H2O——→2NH3+CO2
NH2
NH3?2(HgI2?2KCL)?3NaOH?O?Hg?NH2I?4KI?2H2O?3NaI Hg奈斯勒试剂 碘化双贡铵（橙黄色）
取4支试管，编号，向每支试管中加入脲酶提取液1毫升。将第1号试管放在冰水里冷却，第2号试管在室温上放置，第3号试管在50℃恒温水浴中保温，第4号试管在沸水中煮。5分钟后分别向4支试管中加入1%尿素溶液1毫升，混匀，10分钟后取出4支试管，将第3，4号试管用流动的自来水冷却至室温。然后向4支试管中加入奈斯勒试剂5滴，摇匀。观察比较各试管颜色深浅，并说明温度对脲酶活性的影响。 （四）pH对酶活性的影响
（一）取4个50毫升锥形瓶，编号。按下表中的比例，用吸量管添加0.2M磷酸氢二钠溶液0.1M柠檬酸溶液，制备pH5.0~8.0的4种缓冲液。
编号 1 2 3 4
从4个锥形瓶中各取缓冲缓3毫升，分别放入4支带有号码的试管中，随后于每个试管中添加0.3%NaCl 0.5%淀粉溶液2毫升和稀释200倍的唾液2毫升，向各试管中加入稀释唾液的时间间隔为1分钟。将各试管中物质混匀，并依次置于37℃恒温水浴中保温。
待向第4管加入唾液2分钟后，每隔1分钟由第3管取出1滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴碘化钾—碘溶液，检验淀粉的水解程度。待混合液变为棕黄色时，向所有试管依次添加1—2滴碘化钾—碘溶液，加碘化钾—碘溶液的时间间隔，从第1管起，亦均为1分钟。
观察各试管中物质呈现的颜色，分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。
五、实验报告
以表格的形式总结酶的特异性及各种因素对酶促仅应的影响，并解释结果。
六、思考题
1、什么是酶的特异性？本实验结果为什么能说明酶具有这种性质？
2、用煮沸后的蔗糖酶水解淀粉或蔗糖会产生什么现象？这种试验与操一(一)的作法有何区别，试说明酶学实验中安排对照实验的必要性。
3、激活剂与变性剂有何不同？试举例说明。 4、抑制剂与变性剂有何不同？试举说明。
5、为什可以用碘化钾—碘溶液作指示剂检查温度对唾液淀粉酶活性的影响？
6、酶在干燥的情况下与在水溶液中，它的活性受温度的影响是否相同？这种性质对酶的保存有何意义？
7、酶反应的pH是否是一个常数？它与哪些因素有关？这性质对于选择测定酶活性的条件有什么意义？
8、通过几个酶实验，你对下面问题如何认识？
0.2M磷酸氢二钠 Na2HPO4(毫升) 5.15 6.05 7.72 9.27 0.1M柠檬酸 C6H8O7H2O(毫升) 4.85 3.95 2.28 0.28 缓冲液pH 5.0 5.8 6.8 8.0 （1）酶作为生物催化剂具有哪些特性/
（2）进行酶的实验必须注意控制哪些条件？为什么？