蒸馏水 1000mL
A2.3.2 制法
将琼脂加到 900mL 蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨，混匀使溶解， 再加入蒸馏水补足至 1000mL，调整 pH 至 7.2～7.4。趁热用脱脂棉和砂布过滤，再加入乳糖， 混匀，定量分装于烧瓶内，115℃灭菌 20min。作为储备培养基贮存于冷暗处备用。
临用时，加热融化储备培养基，待冷至 60℃左右，根据烧瓶内培养基的容量，加入一 定量的已灭菌的 2％伊红水溶液和 0.5％美蓝水溶液，充分摇匀（防止产生气泡）。倾注平皿 备用。
A2.4 乳糖蛋白胨培养液 A2.4.1 成分
蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 乳糖 5g 氯化钠 5g 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液 1mL 蒸馏水 1000mL
A2.4.2 制法
将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠加热溶解于 1000mL 蒸馏水中，调整 pH 到 7.2～7.4， 加入 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液 1mL，充分混匀，分装于内有倒管的试管中。115℃下灭菌 20min。
贮存于冷暗处备用。 A2.5 革兰氏染色液 A2.5.1 结晶紫染色液
结晶紫 1g 95％乙醇溶液 20mL 1％草酸铵水溶液 1000mL 将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵水溶液混合。 A2.5.2 革兰氏碘液
碘 1g 碘化钾 2g 蒸馏水 300mL
将碘与碘化钾混合，加入蒸馏水少许，充分摇匀，待完全溶解，再加入蒸馏水至 300mL。
A2.5.3 脱色液
95％乙醇。
A2.5.4 沙黄复染液
沙黄 1g 95％乙醇 2g 蒸馏水 90mL 将沙黄溶于 95％乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 A2.6 染色法
染色的基本步骤为：1）涂片：在载玻片上滴加一滴生理盐水，用灭菌的接种环取菌落 少许，与生理盐水混匀，涂布成薄膜；2）干燥：在室温中使自然干燥；3）固定：将涂片迅
速通过火焰 2～3 次，以载玻片反面接触皮肤，热而不烫为度；4）染色：滴加结晶紫染色液，
染色 1min，水洗；5）媒染：滴加革兰氏碘液，作用 1min，水洗；6）脱色：滴加 95％乙醇 脱色，约 30s，水洗；7）复染：滴加复染液，复染 1min，水洗。
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革兰氏阳性菌染色后呈紫色，革兰氏阴性菌染色后呈红色。
注：亦可用 1：10 稀释的石炭酸复红染色液作复染剂，复染时间为 10s。
A3 检验程序
检验程序见图 A.
样品处理：确定样品接种量 发酵试验：将样品接种于乳糖胆盐培养液 44℃、培养24h 平板分离：将产酸发酵管液接种于EMB 37℃、培养18～24h 鉴定：挑取可疑菌落革兰氏染色、镜检 鉴定：挑取革兰氏阴性无芽孢杆菌接种于乳糖蛋白胨培养液 44℃、培养24h 计数：根据产酸产气的阳性管数查MPN表 检验结果报告
图 A污水、污泥中粪大肠菌群检验程序
A4 操作步骤 A4.1 样品准备 A4.1.1 污水
污水样品应至少取 200mL，使用前应充分混匀。
根据预计的污水样品中粪大肠菌群数确定污水样品接种量。粪大肠菌群数量相对较少
的接种量一般为 10mL、1mL、0.1mL。粪大肠菌群数较多时接种量为 1mL、0.1mL、0.01mL 或
0.1mL、0.01mL、0.001mL 等。
接种量少于 1mL 时，水样应制成稀释样品后供发酵试验使用。接种量为 0.1mL、0.01mL
时，取稀释比分别为 1:10、1:100。其它接种量的稀释比依此类推。
1:10 稀释样品的制作方法为：吸取 1mL 水样，注入到盛有 9mL 灭菌水的试管中，混匀， 制成 1:10 稀释样品。因此，取 1mL1:10 稀释样品，等于取 0.1mL 污水样品。其它稀释比的 稀释样品同法制作。
注 1：若样品为经过氯消毒的污水，应在采样后立即用 5％硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。
A4.1.2 污泥
污泥样品应至少取 200g，使用前应充分混匀。
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根据预计的污泥样品中粪大肠菌群数量确定污泥样品接种量。粪大肠菌群数量相对较 少的污泥样品接种量一般为 0.1g、0.01g、0.001g。粪大肠菌群数量较多时接种量为 0.01g、 0.001g、0.0001g 或 0.001g、0.0001g、0.00001g 等。
污泥样品应制成稀释样品后供发酵试验使用。接种量 0.1g、0.01g、0.001g 的稀释样
品制作方法如下：取 20g 污泥样品，加入到三角烧瓶中，加灭菌水使成 200mL，混匀，制成
1:10 稀释样品。吸取 1:10 稀释样品 1mL，注入到盛有 9mL 灭菌水的试管中，混匀，制成 1:100 稀释样品。按同法制成 1:1000 稀释样品。接种 1mL1:10、1:100、1:1000 稀释样品等于接种 0.1g、0.01g、0.001g 污泥样品。
注 1：若样品为经过氯消毒的污泥，应在采样后立即用 5％硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。
A4.2 发酵试验
将样品接种于装有乳糖胆盐培养液的试管（内有小倒管）中，44℃培养 24h。样品接种 体积以及管内乳糖胆盐培养液的浓度与体积根据以下条件确定：
样品为污水时，取三个接种量、每个接种量的样品分别接种于 5 个试管内，共需 15 个 试管。试管内乳糖胆盐培养液的浓度与体积应根据接种量确定。若接种量为 10mL，吸取 10mL 样品接种于装有 5mL 三倍浓度乳糖胆盐培养液的试管内；若接种量为 1mL 时，吸取 1mL 样品 接种于装有 10mL 普通浓度乳糖胆盐培养液的试管内；若接种量少于 1mL 时，吸取 1mL 稀释 样品接种于装有 10mL 普通浓度乳糖胆盐培养液的试管内。
样品为污泥时，取三个接种量、每个接种量的稀释样品分别接种于 3 个试管内，共需 9 个试管。9 个试管中，各装有 10mL 乳糖胆盐培养液。各个试管接种稀释样品体积均为 1mL。 A4.3 平板分离
大肠杆菌分解乳糖产酸时培养液变色、产气时小倒管内出现气泡。经 24h 培养后，将产 酸的试管内培养液分别划线接种于 EMB 培养基上。置于 37℃培养箱中，培养 18～24h。 A4.4 鉴定
挑选可疑粪大肠菌群菌落，进行革兰氏染色和镜检。可疑菌落有：1）深紫黑色，具有 金属光泽的菌落；2）紫黑色，不带或略带金屑光泽的菌落；3）淡紫红色，中心色较深的菌 落。
上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取上述典型菌落 1～3 个接种于 盛有 5mL 乳糖蛋白胨培养液倒管和倒管的试管内，置于 44℃培养箱中培养 24h。产酸产气试 管为粪大肠菌群阳性管。 A5 计数
根据证实有粪大肠菌群存在的阳性管数，查表 A1 或 A2 可得 100mL 污水或 1g 污泥中 粪大肠菌群 MPN 值。
由于表 A1 和表 A2 是按一定的三个 10 倍浓度差接种量设计的（污水接种量为 10mL、1mL 和 0.1mL，污泥接种量为 0.1g、0.01g 和 0.001g），当采用其他三个 10 倍浓度差接种量时， 需要修正表内 MPN 值，具体方法如下：
表内所列污水（污泥）最大接种量增加 10 倍时表内 MPN 值相应降低 10 倍；污水（污泥）
最大接种量减少 10 倍时表内 MPN 值相应增加 10 倍。如污水接种量改为 1mL、0.1mL 和 0.01mL 时，A1 表内 MPN 值相应增加 10 倍。其它的三个 10 倍浓度差接种量的 MPN 值相应类推。
由于 A1 表内 MPN 值的单位为每 100mL 污水样品中 MPN 值，而污水以 1L 为报告单位，因 此需将查 A1 表得到的 MPN 值乘上 10，换算成 1L 污水样品中的 MPN 值。
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表 A1污水中粪大肠菌群最可能数（MPN）检索表
（污水样品接种量为 5 份 10mL 水样，5 份 1mL 水样和 5 份 0.1mL 水样） 每 阳性管数 每 阳性管数 接种 阳性管数 接种 水样 水样 接种 水样 100mL 水样中 MPN 接种 水样 接种 水样 接种 水样 100mL 水样中 MPN 接种 水样 接种 水样 接种
每 100mL 100mL 10mL 0.1mL 100mL 10mL 0.1mL 100mL 10mL 0.1mL 水样中 水样 MPN 12
0 0 0 0 2 0 0 5 4 0 0 13 0 0 1 2 2 0 1 7 4 0 1 17 0 0 2 4 2 0 2 9 4 0 2 21 0 0 3 5 2 0 3 12 4 0 3 25 0 0 4 7 2 0 4 14 4 0 4 30 0 0 5 9 2 0 5 16 4 0 5 36 0 1 0 2 2 1 0 7 4 1 0 17 0 1 1 4 2 1 1 9 4 1 1 21 0 1 2 6 2 1 2 12 4 1 2 26 0 1 3 7 2 1 3 14 1 1 3 31 0 1 4 9 2 1 4 17 4 1 4 36 0 1 5 11 2 1 5 19 4 1 5 42 0 2 0 4 2 2 0 9 4 2 0 22 0 2 1 6 2 2 1 12 4 2 1 26 0 2 2 7 2 2 2 14 4 2 2 32 0 2 3 9 2 2 3 17 4 2 3 38 0 2 4 11 2 2 4 19 4 2 4 44 0 2 5 13 2 2 5 22 4 2 5 50 0 3 0 6 2 3 0 12 4 3 0 27 0 3 1 7 2 3 1 14 4 3 1 33 0 3 2 9 2 3 2 17 4 3 2 39 0 3 3 11 2 3 3 20 4 3 3 45 0 3 4 13 2 3 4 22 4 3 4 52 0 3 5 15 2 3 5 25 4 3 5 59 0 4 0 8 2 4 0 15 4 4 0 34 0 4 1 9 2 4 1 17 4 4 1 40 0 4 2 11 2 4 2 20 4 4 2 47 0 4 3 13 2 4 3 23 4 4 3 54 0 4 4 15 2 4 4 25 4 4 4 62 0 4 5 17 2 4 5 28 4 4 5 69 0 5 0 9 2 5 0 17 4 5 0 41 0 5 1 11 2 5 1 20 4 5 1 48 0 5 2 13 2 5 2 23 4 5 2 56 0 5 3 15 2 5 3 26 4 5 3 64 0 5 4 17 2 5 4 29 4 5 4 72 0 5 5 19 2 5 5 32 4 5 5 81