分子诊断学习题 Lucas Gu
5.简述磁性球珠分离法分离mRNA的原理。
[本题答案]磁性球珠分离法是基于寡聚(dT)与poly(A)的互补配对特性、用生物素标记寡聚(dT)，通过寡聚(dT)与mRNA 3’端poly(A)形成杂交体，这种杂交非常迅速，在1－2分钟内就可完成，可有效地除去rRNA, tRNA以及其他RNA,而后通过生物素与链亲和素顺磁性磁珠之间的相互作用来捕获这些杂交物而达到分离纯化。
重组DNA技术
一、选择题
1、下列有关重组DNA技术的叙述，正确的是（ ） A．重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和运载体 B．所有的限制酶都只能识别一种特定的核苷酸序列 C．选细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快 D．只要目的基因进入了受体细胞就能成功实现表达
2、下列不属于获取目的基因的方法是（ ） A．“鸟枪法” B．转录法 C．反转录法
D．根据已知氨基酸序列合成法
3、作为基因的运输工具-运载体，必须具备的条件之一及理由是（ ）
A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因
B．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达 C．具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件 D．能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选
4、基因治疗是把健康的外源基因导入（ ） A．有基因缺陷的DNA分子中 B．有基因缺陷的染色体中 C．有基因缺陷的细胞器中 D．有基因缺陷的细胞中
5、应用重组DNA技术诊断疾病的过程中必须使用基因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是指（ ） A．用于检测疾病的医疗器械
B．用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子 C．合成β-球蛋白的DNA D．合成苯丙羟化酶的DNA片段
6、基因工程的操作步骤：①使目的基因与运载体结合②将目的
三、问答题
1、质粒为细菌染色体外一些双链、共价闭合环状DNA分子，是能够进行独立复制并保持稳定遗传的复制子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主的进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。
质粒一般具有以下特性：①自主复制性，它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制；②质粒不相容性；③可扩增性；④可转移性。 三、问答题
1、 简述质粒的概念和特性，常用的质粒载体有哪几种？ 2、 简述重组DNA技术的原理及技术。 3、 简述黏性末端DNA重组体的构建过程。 4、 举例说出重组DNA技术在医药领域的应用。 答案 一、选择题
1．B 2．B 3．A 4．A 5．B 6．C 二、名词解释
1、限制性核酸内切酶简称限制酶，是一类能识别双链DNA分子中某特定的核苷酸序列，并在识别序列内或附近切割DNA双链结构的核酸内切酶。它是一类专一性很强的核酸内切酶，在基因的分离、DNA结构的分析、载体的改造以及体外重组中均有重要作用。
2、是指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。载体按照基本组成元件的来源不同，可分为质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、粘粒载体、人工染色体载体等。按功能可分为克隆载体和表达载体。
3、黏粒又称柯斯质粒，是一种λ噬菌体以为基础，专门为克隆大片段而设计并和质粒共同构建的杂合载体。它由λ噬菌体DNA的cos位点序列和质粒的复制子构建而成。
5、 把带有目的基因的重组质粒DNA引入受体细胞的过程成为
转化。
6、 将重组噬菌体DNA直接引入受体细胞的过程则称为转染。 7、 若重组噬菌体DNA被包装到噬菌体头部成为有感染力的噬
菌体颗粒，再以此噬菌体为运载体，将头部重组DNA导入受体细胞中，这一过程成为转导，通常成为感染。 C．④①②③ D．③④①②
二、名词解释
1、 限制性核酸内切酶 2、载体 3、黏粒 4、转化 5、转染 6、
转导
基因导入受体细胞③检测目的基因的表达④提取目的基因。正确
理想质粒载体应具备①具有松弛型复制子；②在复制子外存在
的顺序是（ ） 几个单一的酶切位点；③具有插入失活的筛选标记；④分子量相对A．③②④① B．②④①③
较小，有较高的拷贝数。
常见的质粒载体有：pBR322质粒、pUC质粒载体、pGEM
分子诊断学习题 Lucas Gu
系列载体等。
2、重组DNA是在体外利用限制性内切酶，将不同来源的DNA分子进行特异的切割，获得的目的基因或DNA片段与载体连接，从而组成一个新的DNA分子。重组的DNA分子能够通过一定的方式进入相应的宿主细胞，并在宿主细胞中进行无性繁殖，获得大量的目的基因或DNA片段。经重组的DNA分子能在宿主细胞中进行表达，获得相应的蛋白质。
大致步骤包括：①目的基因的获取；②载体的选择；③目的基因与运载体连接成重组 DNA；④重组DNA导入受种细胞；⑤重组体的筛选。
3、目的基因和载体可由同一种限制酶切割后产生，或由不同的限制酶切割形成互补黏性末端，经退火，彼此间很容易按碱基配对原则形成氢键。然后由DNA连接酶催化连接接头处的缺口，形成重组质粒。载体DNA在限制酶切割后，用碱性磷酸酶处理，除去5’端磷酸基，以避免载体DNA自身环化。
4、可以利用重组DNA技术探明致病基因的结构和功能，了解其致病机制；开发基因工程药物和疫苗用于临床；建立基因诊断、治疗技术，为疾病的预防、治疗提供新方法、新技术。具体可用于基因诊断：基因诊断是从基因水平上检测人类遗传性疾病的基因缺陷；基因治疗：是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过载体导入人体靶细胞取代靶细胞中的缺陷基因，从而达到治疗疾病目的的方法；基因工程药物、疫苗和抗体的研究和制备；利用基因敲除或转基因技术可改造生物、培育新的生物品种或用于药物筛选和新药评价等。
临床基因扩增检验技术
一、A型选择题
1．下列哪种不是基因扩增检验技术（D） A．PCR B．LCR C．NASBA D．bDNA E．SDA
2．以下基因扩增检验技术中，哪一种属于等温扩增（E） A．PCR B．RT-PCR C．LCR D．Hybrid capture E．NASBA
3．能使扩增灵敏度提高的方法是（B）
A．多重PCR B．巢式PCR C．原位PCR D．反向PCR E．不对称PCR
4．能对未知序列进行扩增的PCR是（D）
A．多重PCR B．巢式PCR C．原位PCR D．反向PCR E．不对称PCR
5．在定量PCR中，对原始模板准确定量的影响因素中，最大的是（B）
A．原始模板的量 B．扩增效率 C．循环次数 D．扩增产物的量 E．循环阈值 6．外标定量方法最大的缺点是（B）
A．不能测定原始模板的绝对量 B．测定的重复性和精密性有问题
C．标准品制备困难 D．不能排除样本间的测定差异
E．测定必须在扩增的指数期进行 7．最早推出的荧光定量探针是（A）
A．TaqMan探针 B．相邻探针 C．分子信标 D．阴阳探针 E．端粒探针
8．PCR测定中的污染主要是指（D）
A．标本间的交叉法治 B．环境中的细菌污染 C．灰尘污染
D．PCR扩增产物的污染 E．试剂中的污染物 9．UNG防污染预防下列哪种污染（A）
A．产物 B．靶核酸 C．气溶胶 D．标本间 E．病原微生物
10．TaqMan探针采用的是（A）
A．荧光标记的探针 B．生物素标记的探针 C．同位素标记的探针
D．SYBR Green标记引物 E．圆形探针 X型题选择题
1．DNA聚合酶要求下述哪些物质才能进行DNA复制（ABCD）
A．dDNA B．Mg2+ C．引物 D．模板 E．小牛血清白蛋白
2．核酸扩增抑制物的主要来源是（ABCE）
A．血清中的血红素 B．尿标本是的尿素 C．核酸提取中的有机溶剂
D．Mg2+ E．部分抗凝剂
3．临床基因扩增中，弱阳性室内质控样本发生失控，其原因可能是（ABDE）
A．核酸提取中的丢失 B．标本中扩增抑制物残留 C．扩增仪孔间温度不均一
D．Taq酶和/或逆转录酶失后 E．扩增产物污染 二、名词解释 1．聚合酶链反应 2．原位PCR 3．RT-PCR 4．反向PCR 5．多重PCR 6．巢式PCR 7．不对称PCR 8．锚定PCR 9．荧光定量PCR 10．循环阈值 11．TaqMan探针 12．分子信标 13．LCR 三、问答题
1．影响PCR反应的因素有哪些？
2．试证明Ct值与模板DNA的起始拷贝数成反比。 3．简述bDNA信号放大系统的原理。 4．PCR检测技术有何临床应用。
分子诊断学习题 Lucas Gu
5．临床基因扩增检验实验室应如何设置。 6．如何保证临床基因扩增检验实验室的质量。
参考答案
一、A型选择题 5．B 9．荧光定量PCR：荧光定量PCR亦称实时荧光PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号检测整个PCR过程，获得在线描述PCR过程的动力学曲线，最后通过标准曲线对未知模板核酸进行定量分析的方法。
10．循环阈值：循环阈值是在PCR扩增过程中，荧光信号模板DNA的起始拷贝数成反比。
1．D 2．E 3．B 4．D 开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。 Ct值与6．B 7．A 8．D 9．A 11．TaqMan探针：在TaqMan探针法的定量PCR反应体
10．A
X型题：
1．ABCD 2．ABCE 3．ABDE 二、名词解释
1．聚合酶链反应：PCR是利用DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）等在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片断合成的基因体外扩增技术。由变性－退火－延伸三个基本反应步骤构成。
2．原位PCR：是指直接用细胞涂片或石蜡片包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，然后用特异探针进行原位杂交检测含该特异序列的细胞的一种方法。
3．RT-PCR：逆转录PCR是一种检测RNA的方法。其原理是先在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板合成互补的cDNA，再以此cDNA为模板进行PCR反应。
4．反向PCR：是对已知DNA片断两侧的未知序列进行扩增和研究的一种方法。其原理是：用限制性内切酶消化DNA片断，然后用连接酶将酶切产物连接成环状，再用已知序列上两端相反方向的引物进行PCR。
5．多重PCR：是在一次反应中加入多种引物，同时扩增一份DNA样品中的不同序列。每对引物所扩增的产物序列长短不一。根据不同长短的序列存在与否，检测是否有某些基因片断的缺失与突变。多重PCR对于检测疾病相关基因十分庞大的疾病很有价值。
6．巢式PCR：巢式PCR有两对引物，一对引物对应的序列在模板外测，称外引物，另一对引物互补序列在同一模板的外引物的内侧，称内引物，即外引物扩增产物较长，含有内引物扩增的靶序列，经过二次PCR放大将单拷贝的目的DNA序列检出。巢式PCR最大的优点是灵敏度大大提高
7．不对称PCR：不对称PCR的目的是扩增产生特异长度的单链DNA。PCR反应中采用两种不同浓度的引物，一般采用50～100：1比例，最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA，但当低浓度的引物被消耗尽后，以后的循环只产生高浓度引物的延伸产物，结果产生大量单链DNA。因PCR反应中使用二种引物浓度不同，因此称为不对称PCR。
8．锚定PCR：锚定主要用于扩增未知序列或未全知的序列。首先分离总RNA或mRNA，在逆转录酶作用下合成cDNA，通过DNA末端转移酶在cDNA的3′端上加上poly(dG)尾，与此poly(dG)相对应的锚定引物为poly(dC)，为保证扩增特异性，poly(dC)应在十二聚以上，5′端还可带上某些限制性酶序列或其他序列信息。
系中，包括一对引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团，如FAM、VIC等，3′端标有荧光淬灭基团，如TAMRA等。当探针完整时，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收从而产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
12．分子信标：分子信标探针是TaqMan探针的一种衍生方法。探针设计与TaqMan探针相似，只不过是探针5′和3′端的一小段核苷酸序列被设计成互补的，没有与靶序列杂交时会形成发夹状态，此时荧光基团和淬灭基团极端靠近，荧光几乎完全淬灭。探针与靶序列杂交后，发夹展开，荧光基团与淬灭基团分开，荧光得以恢复，荧光检测系统即可接收到荧光基团的荧光信号
13．LCR：连接酶链反应又称为连接酶扩增反应。LCR是以DNA连接酶将某一DNA链的5′磷酸与另一相邻链的3′羟基连接为基础的循环反应。LCR扩增对象不是目标片段，而是由引物组成的探针，是一种探针扩增技术。LCR需要两对引物A、B和A′、B′，其中引物A与引物A′互补，引物B与引物B′互补。模板双链DNA经加热变性后，两对引物分别与模板链复性退火，复性后引物A和B′的3′端分别与引物B和A′的5′端相邻。若引物与模板完全互补，在DNA连接酶的作用下，使得相邻两个引物A和B、A′和B′的5′磷酸与3′羟基形成磷酸二酯键而相连。连接产物变性后，又可作为引物的模板参加反应，使扩增呈指数增长，经过变性-复性（退火）-连接的20～30个循环，检测连接反应的产物。
三、问答题
1．影响PCR反应的因素有哪些？
PCR反应体系包含DNA模板、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、dNTP及含有必需离子的反应缓冲液，这些因素都对PCR反应产生影响。
2．试证明Ct值与模板DNA的起始拷贝数成反比。 一般来说，第n次PCR循环的荧光信号强度（Rn）等于背景信号强度（RB）加上每个分子的荧光强度（即单位荧光强度RS与分子数目的乘积），用数学式表示如下：
Rn = RB +XO（1+Ex）nRs
分子诊断学习题 Lucas Gu
式中：Rn代表荧光信号强度
RB代表背景信号强度 Xo代表起始模板拷贝数 Ex代表扩增效率 Rs代表单位荧光强度 N代表循环次数
当循环次数n=Ct时，则
RT=RB+Xo（1+Ex）CtRs
两边取对数，则
lg（RT-RB）=lgXo+Ct lg（1+Ex）+lgRs
将其整理，则，
lgXo lg(RT-RB)-lgRs 应混合物配制和扩增区以及扩增产物分析区。如果采用全自动扩增仪，后两个区域可以合并。应注意的是，各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。进入各工作区域必须严格按单一方向进行，即试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区。各区的仪器设备包括工作服、鞋子、实验记录本和笔等都必须专用，不得混淆。此外，上述四个工作区域内还应有固定于房顶的紫外灯，以便于工作后区域内的空气照射。
6．如何保证临床基因扩增检验实验室的质量。
临床基因扩增检验实验室的常规测定由一系列步骤组成，包括样本收集、样本处理（核酸提取）、核酸扩增、产物检测结果报告及解释等。室内质量控制仅涉及样本处理、核酸扩增和产物分析等测定分析步骤，而室间质量评价则除了监测测定分析步骤外，还包括较大范围的实验室活动，诸如样本接收中的可靠性、结果报告及解释等。QA则是覆盖更广范围的活动，包括样本收集、结果报告和解释等。
Ct= + lg(1+Ex) lg(1+Ex)
对每一个特定的PCR反应来说,Ex、RT、RB、和Rs都是常数，所发Ct值与lgXo成反比，也就是说，Ct值与起始模板DNA的拷贝数（Xo）的对数成反比，起始DNA浓度每增一倍，Ct值减小一个循环。因此，Ct值的引入确保了实时荧光PCR定量的精确和严格。
3．简述bDNA信号放大系统的原理。
分枝DNA是人工合成的带有侧链的DNA片段，在每个侧链上都可以标记可被激发的标记物。以bDNA为基础建立的连续放大DNA信号以检测DNA的技术称为分枝DNA信号放大系统。
bDNA信号放大系统包括四种杂交探针，即目标探针、前放大体、 放大体和标记探针。首先用亲和素包被微孔，加入目标探针，该组探针能与等检核酸靶序列上不同区域互补，其5′端用生物素标记，能与微孔中的亲和素高度亲和结合；再向微孔中加入待测标本，目标核酸与固定于微孔中的目标探针结合；再加入前放大体，该组探针的一段能与目标核酸的不同区域互补结合，另一段与放大体（即分枝DNA）的主链部分的序列互补结合，分枝DNA由主链和数十根寡核苷酸组成，每个分枝上都有标记探针的杂交位点，由酶标寡核苷酸组成的标记探针与bDNA上的互补序列结合，加入底物后最后经化学发光检测仪检测。利用bDNA信号放大系统可在每个靶序列上结合60～300个酶分子，而且所有杂交反应同时进行，观察到的信号与靶DNA的量成正比，可通过标准曲线将靶DNA定量。
4．PCR检测技术有何临床应用。
（1）PCR在病原微生物的检测中的应用；（2）PCR在遗传病中的应用；（3）PCR在肿瘤中的应用；（4）其它方面的应用：PCR技术除用于临床诊断和治疗外，还可用于DNA指纹、个体识别、亲子关系识别、法医物证等。
5．临床基因扩增检验实验室应如何设置。
由于基因扩增检验是对靶核酸的指数倍扩增过程，因而有大量的扩增产物的出现，这种扩增产物极易对以后的新扩增反应产生“污染”，为防止这种污染的发生，就需要对基因扩增检验实验室进行严格的分区。临床基因扩增检验实验室原则上分为四个分隔开的工作区域，即试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反
核酸分子杂交技术
一、 A型题：
1． 要探知细胞内某一蛋白质的表达水平，可以通过
_______实现。 A. Southern blot B. Northern blot C. Western blot D. 原位分子杂交 2． 核酸的变性是_______。
A. 一级结构的断裂 B. 二级结构的破坏 C. 伴有共价键的断裂 D. 是DNA的降解过程。 3． 固相杂交不包括_______。
A. Northern印迹杂交 B. 原位杂交 C. 吸附杂交
D. Southern印迹杂交 4． 染色体原位杂交结果如图所示
羊水细胞间期核与13、18、21、X和Y 染色体的DNA探针杂交。左图显示细胞核与13号染色体（绿）和21号染色体（红）的探针杂交。右图显示细胞核与18号染色体（浅蓝）、X染色体(绿)和Y染色体（红）的探针杂交 。请根据该结果得出诊断为_______。
A． 21三体