17. 如何溶解引物？
干燥后的引物质地非常疏松，开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟 的转速下离心1分钟，或管垂直向上在桌面上轻敲几次，将引物粉末收集到管底，防止开盖时引物散失。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10 mM Tris pH 7.5缓冲液，室温放置几分钟，上下混匀振荡，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH 4-5），引物在这种条件下不稳定。
我们的合成报告单给出了每管引物稀释为100 μmol/L（即100 pmol/μl）浓度的加水量，您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水（PH > 6.0）或TE缓冲液（PH 7.5-8.0）。
18. 已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？
如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻融，并使用10 mM Tris pH 7.5缓冲液溶解引物。还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。
三、引物的纯度及使用中的常见问题
19. 如何检测引物的纯度？
实验室常见方法是用PAGE法。使用加有7 M尿素的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，碱基数小于12个的引物用20%的胶，12-60个碱基的引物用16%的胶，大于60个碱基的引物用12%的胶。取0.2-0.5 OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性（95 ℃，2 min）。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600 V电压进行电泳，一定时间后（约2-3小时），剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。(有时由于变性不充分，主带之上可能会有条带，乃是引物二级结构条带。)
20. 当引物的OD260/OD280小于1.8时，引物的纯度合格吗？
OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。下表是一个20 mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。
碱基组成
5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3
OD260/OD280 2.50
5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 1.85 5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 1.15 5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3
1.14 1.66
21. 同样的OD用PAGE检测，EB染色为什么深浅不一？
通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，因为EB是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。而合成的单链DNA，只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构,才能被EB染色。由于碱基组成不同，不同引物形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会有差异，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB染色效果就非常差。因此不能用EB染色的方法来进行定量，而应用紫外分光光度计检测。 22. 进行PAGE电泳时，长度完全一样的Oligo DNA为什么泳带不在同一位置？ 这种情况在Oligo DNA越短时越容易发生，长链Oligo DNA之间差别较小。主要有两个原因：
1) A、G、C、T的组份不同，电泳速度不同； 2) DNA的立体结构不同，电泳速度不同。
23. 能否使用Agarose凝胶电泳分析合成的引物？
对引物进行电泳一定要使用变性PAGE电泳。由于引物是单链DNA，容易形成复杂的立体结构，因此进行Agarose电泳时，容易出现多条泳带或无条带的现象，更无法用Agarose电泳进行定量了。
24. 有时候干燥后的引物呈黄褐色，这是DNA的本身颜色吗？
合成的引物可能呈黄褐色，白色或者透明色，这与引物的碱基组成和合成的制备过程有关，序列中A和G含量多的以及OD值大的引物通常呈黄褐色，所以呈黄褐色的引物不会对实验产生任何影响。
25. PCR扩增不出来，跟引物有关吗？
基本上不是。当今发展出各色各样的PCR扩增技术，各色各样的高温聚合酶，就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出，扩增效率低的问题。如槽式PCR就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。有些重复片段、GC含量高的片段扩增，必须采用特殊扩增手段才能扩增出来。 扩增不出，主要是下列两种情况比较常见：
1) RT-PCR。很多基因通过常规RT-PCR方法是很难扩增出来的。RT- PCR成功的关键在于RT反应的RNA质量和目标基因在特定组织和细胞中的含量。
2) 从基因组中扩增。一般情况下，基因在基因组中都是单拷贝，基因组作为模板需要严格控制用量。基因组DNA过高，会影响反应体系中的Mg2+浓度和pH。 26. 合成的引物进行PCR反应时无目的带，怎么办?
PCR反应失败的原因很多，可以从以下几个方面考虑： 1) 引物和模板是否配对，同源性有多大?
2) 引物本身是否有立体结构，或者二条引物之间是否形成高次结构? 3) PCR反应用试剂是否能正常工作?
4) PCR仪是否工作正常? 5) PCR反应条件是否合适?
如果一切正常，还无法解决问题时，我们可以免费重新合成引物一次。 27. PCR扩增有很强的非特异条带，说明引物有污染吗？
不能。我们曾分析过一些非特异条带，测序发现在这些非特异性片段的两头至少可以发现一条引物序列。因此非特异性扩增一般是模板污染（如RNA中污染基因组）或扩增条件不合适所致。
28. 如何将两条互补的单链退火形成双链？
用退火缓冲液（10 mM Tris，pH 7.5-8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA）溶解引物, 将要退火的引物等摩尔数混合，总体积不要超过500 μl，加热到95 ℃ 2 min，然后缓慢冷却至室温（低于30 ℃）即可。退火的产物可以放在4 ℃待用。 29. 引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？
连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。siRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。
四、引物的设计及修饰
30. 引物设计的基本原则是什么？
引物设计的下列原则供您参考：
1) 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 2) 引物长度一般在15-30碱基之间。
3) 引物GC含量在40%-60%之间，Tm值最好接近72 ℃。 4) 引物3′端要避开密码子的第3位。 5) 引物3′端不能选择A，最好选择T。 6) 碱基要随机分布。
7) 引物自身及引物之间不应存在互补序列。
8) 引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。 9) 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 10) 扩增产物的单链不能形成二级结构。 11) 引物应具有特异性。 31. 常用引物设计软件有哪些？
常用的软件有Oligo 6和Primer Premier 5.0。引物设计软件是根据引物设计的指导意见设计而成。其实，PCR扩增的成败最关键的是反应模板的制备和反应条件的控制。引物设计软件的缺点是，有时判断为该基因没有一段区域满足标准引物的要求。 金斯瑞为您提供以下引物设计相关软件：
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引物计算工具 引物设计工具 测序引物设计软件
Real-time PCR 引物设计软件
32. 文献上找到的引物和探针序列能否直接使用？
通常国外的文献可信度比较高，可直接使用；但为了保险起见，最好用blast对引物探针的序列进行必要的验证；或者再进一步用引物设计软件对引物探针的二级结构和退火温度进行分析，这样更有利于您对整个实验的把握。 33. 如何计算引物的Tm值？
Tm值的概念：
DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度，亦即DNA 变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为 DNA 的解链温度(Tm)。
南京金斯瑞采用以下方法计算Tm值：
长度为20 mer及以下的引物，Tm计算公式为： Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)。但这个公式只适用于14~20个碱基的引物，引物的TM值还与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲溶液的离子强度等有关。
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为： Tm = 0.41(% of GC) – 675/L + 81.5 注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量；% of GC = GC个数/引物总碱基数 34. 常见的引物修饰的有哪些?
修饰
说明
5'磷酸化可用于接头、克隆和基因构建以及连接酶催化的连接反
磷酸化
应。3'磷酸化可抗3'外切酶消化的相关实验中，也用于阻止DNA
（Phosphorylation）
聚合酶催化的DNA链延伸反应。 生物素（Biotin）
引物生物素标记，可用于非放射性免疫分析来检测蛋白质、胞内化学染色、细胞分离、核酸分离、杂交检测特异性的DNA/RNA序列、离子通道构象变化等。
地高新经由一个11个原子的间臂连接到脲嘧啶的C5位置，杂交的地高新探针可以由抗地高新抗体来检测。地高新标记的探针可
地高新（Digoxigenin） 用于各种杂交反应，如DNA-DNA杂交（Southern blotting）、
DNA-RNA杂交（Northern blotting）、斑点杂交（Dot blotting）、克隆杂交、原位杂交以及酶联免疫分析（ELISA）。