分子生物学实验
学院：生命科学
班级：生技103
姓名：赵辉
学号：2010013654
西北农林科技大学
2012. 6
1
目 录
质粒DNA的提取与电泳检测 P38的PCR及酶切
GFP和TA克隆的转化和观察
植物基因组DNA提取，酶切及电泳
植物RNA提取，电泳及PT—PCR扩增
Southern杂交
2
质粒DNA的提取与电泳检测
P38的PCR及酶切
一、目的
1. 学习碱裂解法提取质粒的原理。
2. 学习PCR反应的基本原理和实验技术，了解引物设计的一般要求。 3．学习质粒的酶切及电泳分析。
二、原理
1．质粒DNA提取：
质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA分子。它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。目前，经人工改造的质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。
质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。现在常用的方法有：碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
2. PCR原理: 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术。利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片段，以用于基因工程操作。 PCR进行的基本条件：
⑴DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA） ⑵引物
⑶dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ⑷Taq DNA聚合酶 ⑸反应缓冲体系
PCR循环由三个步骤组成：
⑴变性 使模板DNA解离成单链；
⑵退火 使引物与模板DNA所需扩增序列结合；
⑶延伸 DNA聚合酶利用dNTP合成与模板碱基序列互补的DNA链。
每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
引物设计：要保证PCR反应能准确，特异，有效的对引物DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下原则：
⑴引物长度：15~25个核苷酸；
3
⑵GC含量为40%~60%；
⑶Tm值为55℃（Tm=4（C+G）+2（A+T）计算； ⑷引物与非特异配对位点的配对率小于70%；
⑸引物自身配对形成的茎环结构，茎的碱基对小于3， ⑹两条引物间配对碱基数小于5个。
由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设计。 本实验以实验二中提取的质粒DNA为模板，进行PCR扩增，大量得到目的DNA片段。
3. 酶切与电泳
限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。
限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。
质粒DNA在细胞内有三种构象：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；③线状DNA，双链DNA断开成线状。电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。因此在本实验中，质粒在电泳中呈现2~3条区带。
三．步骤
1.裂解法提取质粒： （一）培养细菌
将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上，37℃培养24小时，然后从平板上挑取单菌落，接种于5ml液体培养基中，37℃培养12小时。 （二）提取步骤
1、将菌液移入1.5ml 离心管，离心30秒（13000rpm），倒去上清液，如收集3ml 菌液，重复一次，倒转于滤纸除净残液。
2、加入100μl预冷的溶液Ⅰ(含5ug/μl RNAase)，用涡旋震荡器充分悬浮。
3、加入150μl溶液Ⅱ，快速颠倒温和混匀，室温放置5分钟。此时溶液应非常粘稠。 4、加入150μl 预冷的溶液Ⅲ，温和混匀（此时应有可见沉淀），在冰浴中5分钟。 5、12000rpm离心3分钟。转移上清液至另一1.5ml离心管中。
6、加800 μl乙醇到上清液中，混匀， 12000rpm离心5分钟，除去上清（尽可能除去残液）。
7、用0.5ml 70% 乙醇洗DNA沉淀一次，离心2分钟，除去乙醇（尽可能除去残液）。 8、离心干燥DNA。
9、加40μl TE溶解DNA，待用（或-20℃保存）。
2. PCR:
（一）PCR扩增
1、按下表加入试剂，并小心混匀。模板为实验一中提取的质粒DNA。 试剂 ddH2O 10 x buffer
体积（ 50μl） 31.5μl 5μl 4