辽宁医学院医疗学院2015届本科生毕业论文
前 言
硒作为动物机体必需的微量元素，是机体自由基的清除剂（徐辉碧等，1987；胡松洲等1987），它与其它抗氧化物质共同构成机体内抗氧化防御系统，维持体内自由基动态平衡，使组织细胞中的不饱和脂肪酸及其它脂类不被氧化。自然界中的硒通过食物链由土壤到植物，再到动物，因此动物体内的硒含量密切地依赖于动物所采食饲料中的硒含量。世界上许多国家都存在严重的缺硒地区，而我国又是严重的缺硒国家之一，因此硒缺乏症作为一种危害多种动物的世界性疾病，给我国养殖业带来巨大的经济损失。硒缺乏会引起机体含硒酶等抗氧化酶活性的降低，导致自由基清除受阻、内分泌紊乱、机体免疫力下降等一系列机体功能障碍，进而导致疾病的发生（Dunbar，et al，1993）。近年来硒缺乏对动物机体影响的研究已成为国内外研究的焦点和热点。 1.1 硒在动物体内的吸收、分布、代谢
动物机体所有组织和细胞中都含有硒，含量视组织和摄食硒水平而异。进入机体内的硒主要在十二指肠吸收，胃和大肠几乎不吸收，但是吸收因饲料中的硒含量、存在形式及干扰元素的种类和水平而异，一般有机硒的生物利用率大于无机硒，植物性饲料硒的生物利用率大于动物性饲料（张巧娥等，2001）。硒被动物机体吸收后首先进入血液，大部分与血浆白蛋白结合，小部分与球蛋白形成不牢固结合，并有部分进入红细胞内，然后由血液转运到全身各个组织和器官。在日粮硒含量正常的情况下，机体组织中的硒含量分布按肾、肝、胰、脾、心、骨、肌肉、脂肪顺序，依次递减（李辉等，2003）。肝有贮蓄过量硒的功能，当体内缺硒时肝中的硒向全身输送。在正常情况下，动物体内的硒主要通过尿和粪便等途径排泄。当采用注射或饲喂高硒物质时，将产生大量挥发性甲基化硒代谢产物（二甲基硒化合物），后者主要是通过肺呼出（毛胜勇，2000）。 1.2 硒对机体免疫功能的影响
机体发挥正常免疫功能需要有一定水平硒的参与（陶新等，2001）。缺硒可影响免疫系统的发育和功能，适量补充硒，可提高T、B 淋巴细胞、NK细胞和吞噬细胞等免疫细胞活性，增强机体非特异性免疫及细胞免疫、体液免疫功能（Margaet，2000；王栋钢等，2003；张静，2006）。但是补硒要适量，超过安全摄入量则会引起硒中毒。 1.3 硒缺乏与氧化应激
动物机体在代谢过程中，将不断产生自由基（如超氧自由基）和过氧化物（如H2O2）等各种对机体有害的物质，这些物质过量极易将机体生物膜过氧化为脂质过氧化物，破坏膜结构，并造成组织细胞严重损伤。抗氧化防御系统是动物机体在进化过程中形成的一套完整而复杂的防御系统，它包括抗氧化酶（如SOD、GSH-Px、CAT等）、脂溶性的抗氧化剂（如维生素E、辅酶Q等）、水溶性小分子抗氧化剂（GSH、维生素C等）以及蛋白性抗氧化剂（铜蓝蛋白、金属硫蛋白等）等，这些抗氧化物质在机体清除自由基，防止各种病理变化的发生发展中发挥重要作用（陈瑗，2004；郑荣梁，2007）。
硒在体内主要以有机硒化合物形式存在，分两类：一类是含硒氨基酸，一类是含硒蛋白质。一般将以硒代半胱氨酸形式将硒共价结合到多肽链的蛋白质称硒蛋白，目前发现的硒蛋白大多是重要的功能酶，如GSH-Px，硫氧还蛋白还原酶（TR）、碘甲腺原氨酸脱碘酶（ID）等。GSH-Px 家族是体内最强的抗氧化酶，硒是以半胱氨酸的形式位于其活性中心上（Arthur，2000）。普遍认为硒主要通过硒蛋白GSH-Px发挥其抗氧化作用，保护机
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体免受氧化损伤。硒蛋白GSH-Px的抗氧化作用包括分解脂质过氧化物、清除脂质过氧化自由基中间产物、修复自由基引起的巯基化合物的分子损伤、在自由基破坏生命物质之前将其清除或转化为稳定化合物和催化巯基化合物作为保护剂的反应，从而维持生物膜系统的完整性（范华注等，1987；徐辉碧等，1991）。GSH-Px与缺硒引起的病变呈正相关，硒缺乏时GSH-Px的活性快速降低，在硒的恢复过程中，GSH-Px活性的升高需要更大剂量的硒和更长的时间，因此可以通过测定GSH-Px的活性来判断缺硒和缺硒性疾病。目前已发现了四种依赖于硒的GSH-Px，分别命名为GSHPx-1、GSHPx-2、GSHPx-3和GSHPx-4。GSHPx-1是细胞内的 GSH-Px，是大鼠体内数量最多的一种硒蛋白，几乎存在于所有的细胞中，它以还原型谷胱甘肽（GSH）为底物，催化还原不同种类的氢过氧化物，从而清除组织中有害的氢过氧化物和自由基，对保护生物膜结构和功能的完整发挥重要的作用。GSHPx-2位于胃肠道内，是一种细胞内酶，它能很专一地保护食物免受 H2O2的损害，这种酶在阻止胃肠道癌症进行性变化中，显得特别重要（Wingler，et al，1999）。GSHPx-3是细胞外或血浆GSH-Px，主要由肾脏分泌，但肝和乳腺也可产生，它可还原酯化的氢过氧化物和游离的氢过氧化物，细胞外GSH-Px以控制细胞外氢过氧化物来协助细胞内的GSH-Px来发挥作用。GSHPx-4也称为磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶（PHGPx），是一种膜结合蛋白，具有界面性，能作用于膜和水之间的界面，对磷脂氢过氧化物的活性较高，对保护生物膜的完整性具有重要意义。GSHPx-4存在于许多组织中，其中以睾丸中的含量最丰富，它位于膜而不在胞浆（Roveri，1994），此酶被认为在预防脂质过氧化中起主要作用，因为它是能还原磷脂中脂肪酸氢过氧化物唯一的细胞内GSH-Px。Ursini（1999）研究发现在成熟精子尾部中段，线粒体被囊物质中至少50%是GSHPx-4。基于这些发现，推测硒蛋白GSHPx-4在精子成熟过程中具有双重作用，即在精子发育早期，GSHPx-4以酶的活性形式存在发挥抗氧化功能，而在成熟精子中该蛋白物理特性和生物学作用均有所改变，以无活性的、不可溶的蛋白质形式持续存在（倪银星，2002；高建忠，2004）。 大量研究表明，给动物补充适量的硒制剂可提高机体内抗氧化酶的活性，进而提高机体抗氧化能力。许飞利（2007）研究发现饲料中添加硒可以显著提高鸡血清中GSH-Px和SOD的活性，且两种酶的活性都随着日粮中硒添加量的上升而增加。胥保华等（2005）研究表明饲料中亚硒酸钠添加浓度在0.20~0.4 mg/kg时GSH-Px的活性最佳。甘璐等（2003）研究了不同剂量的硒对大鼠肝脏抗氧化功能的影响，结果发现补硒20 μg/kg的大鼠，机体内反映脂质过氧化水平的MDA含量降低，同时 SOD、CAT和GSH-Px活性增高，说明硒通过提高机体内抗氧化酶的活性有效抑制大鼠肝脏的脂质过氧化。蒋英子等（2005）研究发现，有机硒能够通过提高GSH-Px的活性而降低由CCl4诱导的小鼠肝脏脂质过氧化损伤的发生。苏传福（2008）研究表明日粮中不同的硒含量对草鱼肝胰脏和血清抗氧化酶活性及MDA含量和T-AOC有显著影响P<0.05），硒含量为0.66 mg/kg时，可显著提高草鱼血清和肝胰脏CAT、GSH-Px 活性及T-AOC，降低血清和肝胰脏MDA浓度，草鱼肝胰脏和血清中的抗氧化酶系统总体达到相对平衡，有效地抵抗氧化损伤。章子贵等（2005）研究表明低硒能引起机体抗氧化酶系的紊乱及氧化损伤，从而影响免疫系统。张
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丹英等（2008）研究了低硒、低碘对大鼠肝脏某些生化指标的影响，结果显示低硒组大鼠肝脏中GSH-Px 活性明显降低，MDA、NO含量明显升高。当机体硒含量或GSH-Px活性降低时，都将会导致淋巴细胞代谢过程中脂质过氧化物作用的相对增强，过多的过氧化物扩散到细胞的各个部位，扰乱各种酶的正常生化功能，引起各种生物膜的损伤，最终导致机体的细胞免疫和体液免疫等免疫防御体系的损伤及免疫功能的降低（Brown，et al，2000）。Tapiero等（2003）和 Lewin等（2001）也证实了硒缺乏可影响机体的抗氧化能力，导致氧化应激的发生。以上研究表明，低硒能扰乱机体抗氧化防御系统的平衡，导致机体氧化应激，引起免疫抑制和机体损伤。 1.4硒缺乏与NO 代谢
自由基是体内正常的代谢产物，对维持机体正常的生理功能具有重要意义。其中，NO是较为重要的自由基，它作为一种生物信使分子和细胞毒效应因子近年来引起极大的关注。NO是在辅酶Ⅱ（NADPH）、钙调蛋白、血红素等辅助因子的作用下，由一氧化氮合酶（NOS）以 L-精氨酸（L-Arg）和氧分子为底物，催化L-Arg产生的（武瑞，2001）。生理条件下，动物体内的NO维持动态平衡，参与机体的新陈代谢和贮能，参与细胞的解毒功能等，但是高浓度的NO具有细胞毒性作用，可以与超氧阴离子结合生成过氧亚硝酸根（ONOO-） ，ONOO-及其分解产物可引起膜的脂质过氧化，导致细胞膜结构和功能的破坏，同时还通过抑制DNA合成及线粒体呼吸等途径引起组织损伤（张艳淑等，2000）。 研究表明硒可干扰细胞内NO的代谢。许龙兵等（2005）研究表明，富硒乳酸菌可以抑制镉诱发小鼠血浆中NO含量的升高和TNF-α的释放，从而缓解镉对组织的损伤作用。赵洪进等（2006）研究结果显示富硒酵母可显著降低肝癌大鼠血浆和肝组织的NO含量和NOS活性显著，全血和肝组织中GSH-Px升高，表明富硒酵母能提高抗氧化酶的活性，抑制NO的产生，清除体内大量过剩的氧自由基，从而减轻NO等自由基所致的脂质过氧化损伤。低硒也可引起NO含量的变化。庄惠君等（2004）通过复制硒缺乏动物模型来检测富硒蘑菇对小鼠睾丸脂质过氧化和精子活力的影响，测定了睾丸中硒、MDA和NO含量，GSH-Px和NOS活性，结果表明，富硒蘑菇具有提高含硒酶GSH-Px活性，降低NOS活性和NO含量，从而减轻自由基对睾丸损伤作用。金明昌（2007）在研究幼鲤硒缺乏症及其机制和硒需要量时发现硒缺乏可导致幼鲤血清和肝脏中NOS活性增强，NO含量升高。仝宗喜（2004）研究显示硒缺乏可引起鸡胸腺和血清内NO代谢发生改变。 1.5 试验的目的和意义
硒作为鸡必需的一种微量元素，对鸡生长、发育、繁殖等方面都起着极为重要的作用。硒缺乏会引起机体抗氧化能力降低，导致自由基清除受阻、内分泌紊乱、机体免疫能力下降等一系列机体功能障碍，进而导致疾病的发生。世界上许多国家都存在严重的缺硒地区，而我国又是缺硒严重国家之一，缺硒病在个别区域仍时有发生，因此对硒的研究显得至关重要。目前国内外学者对畜禽硒缺乏症在流行病学、致病原因、临床症状、剖检变化、发病机理等方面进行了大量的研究，但是硒缺乏致鸡免疫抑制的机制研究较少。
本试验通过给雏鸡饲喂自配的低硒饲料复制硒缺乏鸡模型，检测鸡胸腺在揭示硒缺乏
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致鸡GSH-Px、SOD和MDA的影响，为硒缺乏病的诊断和治疗提供科学的理论基础，为比较医学提供借鉴。
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