M13噬菌体 下载本文

第一,单链DNA噬菌体的复制,是以双链环形DNA为中间媒介的。这种复制形式的DNA(replication form DNA,简称RFDNA),可以如同质粒DNA一样,在体外进行纯化和操作。

第二,不论是RF DNA还是ssDNA,它们都能够转染感受态的大肠杆菌寄主细胞,并依据所采用的实验方法而定,或产生出噬菌斑,或形成浸染的菌落。 第三,单链DNA噬菌体颗粒的大小,是受其DNA多寡制约的。因此对它们来说,并不存在包装限制的问题。

第四,应用这类单链DNA噬菌体,可以容易地测定出外源DNA片段的插入取向。

第五,可产生大量纯化的含外源DNA片段插入的单链DNA分子。这种重组体单链DNA分子可按双脱氧链终止法作核苷酸序列测定,也可用于制备具放射性同位素标记的DNA探针,还可进行寡核苷酸定点突变。 下面以M13噬菌体为例子加以说明。

一.M13噬菌体的生物学特性

M13噬菌体颗粒的外形呈丝状,在颗粒中包装的仅是(十)链的DNA,有时亦称为感染性的单链(图5-11)。

M13噬菌体首先吸附在F性须上,其吸附的位点看来是在性须的末端(图5-12)。噬菌体的基因组从性须末端进入到细胞的内部,进入细胞内部的M13(+)链DNA,便起到一种模板的作用,合成出互补的(一)链 DNA。由此形成的双链形式的M13DNA,称为复制型 DNA。它按θ形式进行几轮复制之后,基因 Ⅱ的产物便在RFDNA的正链待定位点上作切割反应,形成一个缺口。这样,M13基因组的扩增活动便正式开始启动。其基本特点是利用大肠杆菌的DNA聚合酶I,以环形的MI3(一)DNA为模板合成 M13(+)DNA。当DNA复制叉沿着模板DNA分子转移到复制终点时,在基因Ⅱ编码产物的作用下,新合成的(十)DNA便会被切除下去,并进一步环化形成单位长度的 M13基因组DNA(图5-13)。

二.M13克隆体系

(1)β-半乳糖苷酶显色反应原理

M13克隆体系,包括M13噬菌体本身和寄主菌株两个组成部分,只有将两者结合在一起时,才能形成有功能的β-半乳糖苷酶,而且这种酶的活性还可以用Xgal显色反应法测定出来。 所谓顺反子内互补作用,是指编码同样的多肽链序列但又各具有一个突变的两个基因,联合产生出一种有功能活性的蛋白质多肽的生化过程。

顺反子互补作用偶然也能够以多肽片段的形式出现。M13克隆体系就是一个典型的例子。lac缺失突变lacZ(△M15),简称M15基因(不要同M13噬菌体混淆),合成的是一种缺失了11~41氨基酸的缺陷性的β-半乳糖苷酶(又称M15多肽)。这段缺失虽然不是位于酶分子的活性部位,但却使它失去了四聚化作用的功能。在体外加入野生型的β-半乳糖苷酶的溪化氰片段(cyanogen bromide fragment)(2~92氨基酸),就可以使多肽的活性得以恢复,并重新获得形成四聚体的能力。因此,我们说澳化氰片段补偿了lacZ基因的 M15突变。

这种现象叫做α-互补作用(alpha complementation)。

在M13克隆体系中,当M13mPl载体感染了JM101菌株,通过A互补作用,这些细胞便会产生出有活性的β半乳糖苷酶,于是在补加有指示剂Xgal和诱导物IPTG的培养基中,就会出现蓝色的噬菌斑。 (2)M13载体系列的发展

在M13噬菌体基因Ⅱ和IV之间(从第5498个核苷酸起到第6O05个核苷酸止),有一个长度为 507个核苷酸的基因间区段(intergenic region,IG区段)。通过在这个基因间区段内插入外源 DNA片段,对 M13噬菌体进行改建,并因此成功地发展出了M13克隆载体系列。 (3)M13载体系列的优点

M13载体系列特别适用于克隆单链的DNA分子。它具有两个十分有用的优点:第一个优点是,在这类载体的基因组中有一条饰变的β半乳糖苷酶基因片段(Hindll片段),其中插入了一段具有密集的多克隆位点(polycloning site)的序列(图5-14);第二个优点是,M13载体系列是应用基因工程技术成对地构建的,可以有效地克隆双链DNA分子中的每一条链。