生 物 化 学 实 验 讲义
实验十一、紫外吸收法测定核酸的含量
一.实验目的
学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法，熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。 二.实验原理
核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（－C＝C一C＝C一），能够强烈吸收250~280nm波长的紫外光。核酸（DNA，RNA）的最大紫外吸收值在260nm处。遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。 在不同pH溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。
采用紫外分光光度法测定核酸含量时，通常规定：在260nm波长下，浓度为1μg/mL的 DNA溶液其光密度为0.020，而浓度为1μg/mL的RNA溶液其光密度为0.022。因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液的光密度OD260nm，即可计算测出其中核酸的含量。
该法简单、快速、灵敏度高，如核酸3μg／mL的含量即可测出。对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小，若样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质，测定误差较大，应设法事先除去。
由于降解或水解作用，核酸的光密度可以增高约40％，这就是众所周知的增色效应（hyperchromic effect）。在大分子的核酸中，氢键和π-键相互作用改变了碱基的共振行为。因此，核酸的光密度低于构成它的核苷酸的光密度，该现象称为减色效应（hypochromic effect）。 三、实验器材
1．试材：核酸样品DNA或RNA。 2． 主要仪器
（1）分析天平 （2）紫外分光光度计 （3）冰浴或冰箱 （4）离心机 （5）离心管（10mL） （6）烧杯（10mL） （7）容量瓶（50mL、100mL） （8）移液管（0.5ml、2mL和5mL） （9）药品勺和玻璃棒 （10）试管和试管架。 四、试剂
（1）5%~6%氨水：用25%~30％氨水稀释5倍。
（2）钼酸铵-过氯酸试剂：取3.6mL70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中。
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五、操作步骤
1．核酸样品纯度的测定
（1）准确称取待测的核酸样品0.5g，加少量蒸馏水（或无离子水）调成糊状，再加适量的水，用5%~6%氨水调至pH7，定容至50mL。
（2）取两支离心管，甲管内加入2mL样品溶液和2mL蒸馏水；乙管内加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂（沉淀除去大分子核酸，作为对照）。混匀，在冰浴（或冰箱）中放置30min，3 000r/min离心10min。从甲、乙两管中分别取0.5mL上清液，用蒸馏水定容至50mL。选用光程为1cm的石英比色杯，在260nm波长下测其光密度。
（3）计算
如果待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，则可将样品配制成一定浓度的溶液（20~50μg/mL）在紫外分光光度计上直接测定。
2．核酸溶液含量的测定
当待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，在测定时需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260 nm处光密度作为对照。
（1）取2支离心管，每管各加入2mL待测的核酸溶液，再向甲管内加2mL蒸馏水，向乙管内加2mL沉淀剂。混匀，在冰浴（或冰箱）中放置10min，3 000r/min离心10min。将甲、乙两管清液分别稀释至光密度在0.1~1.0之间。选用光程为1cm的石英比色杯，在260nm波长下测其光密度OD260nm。
（2）计算
六、结果讨论
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1．采用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，有何优点及缺点？
用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，具有简单、快速、灵敏度高的优点，并且待测核酸样品中含有的微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质，产生较小测定误差。但该法在测定样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质时，则会产生较大测定误差，需要设法事先除去。 2．若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正？
当样品中含有核苷酸类杂质时，需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂处理，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260 nm处光密度，以此作为对照；再从未加沉淀剂测得的样品液260nm光密度中扣除。
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实验十二、化学法测定DNA的含量——二苯胺显色法
一、实验目的
学习利用二苯胺显色法测定DNA的含量的原理和操作
二、实验原理
DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在595nm波长处有最大吸收。DNA在40~400μg范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。
三、实验器材
1.分光光度计 2.烧杯 3.试管 4. 玻璃棒 四、试剂
1． DNA标准溶液
准确称取小牛胸腺的DNA钠盐，以0.01mol／L NaOH溶液配成200μg／mL的溶液。 2． 测定样品溶液
准确称取干燥的DNA制品，以0.01mol／L NaOH溶液配成100~150μg／mL的溶液。若要测定RNA制品中的DNA含量，样品中至少要含有DNA 20μg／mL 才能进行测定。
3． 二苯胺试剂
称取1g二苯胺， 溶于100mL的分析纯的冰乙酸中，再加入60％以上的过氯酸10mL，混匀待用。临用前加入1mL的1.6％乙醛，配好的试剂应为无色。 五、操作步骤
1． 制作DNA标准曲线：取12支洁净干燥试管按表1加入试剂：
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