生 物 化 学 实 验 讲义
鸡蛋清用蒸馏水稀释6倍，通过2~3层纱布滤去不溶物即得。 3、 操作
取少量尿素结晶（火柴头大小），放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨基酸，形成双缩脲。冷却备用，为1号。
再取两支：分别加入卵清蛋白溶液和Glu溶液，为2号和3号。
编 号 10% NaOH （滴） 2% CuSO4 (滴) 现 象 1 双缩脲（少许） 5 1 2 卵清蛋白（1ml） 5 1 3 Glu(1ml) 5 1 在上述三支试管中分别进行如下操作：加10%氢氧化钠溶液约1mL（5滴），振荡混匀，再加2%硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。摇匀，再加2%硫酸铜溶液1滴，随加随振荡。观察紫玫瑰色的出现。
（二）茚三酮反应 1、原理
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应十分灵敏，1：1500000浓度的氨基酸水溶液即能反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
β-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应。尿素、马尿酸、二酮吡嗪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。
茚三酮反应分为两步：第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个水合基本分子和氨缩合生成有色物质。反应机理如下：
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此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过在时甚至不显色。 2、试剂
1）蛋白质溶液 100mL 2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清：水=1：6）
2）0.3% Glu溶液 80mL 3）0.1% 茚三酮水溶液 50mL 3、操作
取2支试管分别加入蛋白质溶液和Glu氨酸溶液1mL，再各加2~3滴0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1~2分钟，观察颜色由粉红色变紫红色再变蓝。
体积（ml） 茚三酮（滴）
（三） 黄色反应 1、原理
含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。反应式如下：
1（卵清蛋白） 1 3 2（Glu） 1 3 3 (Tyr) 1 3
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。 2、试剂
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1）鸡蛋清溶液 100mL 将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀，然后用六层纱布过滤。 2）头发 3）指甲
4）0.3%色氨酸溶液 10mL 5）0.3% 酪氨酸溶液 10mL 6）0.5%苯酚溶液 50mL 7）浓硝酸 200mL 8）40%氢氧化钠溶液 100mL 3、操作
向六个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置，或用微火加热。等各管出现黄色后，于室温下逐滴加入40%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。
管 号 材 料 （滴） 浓硝酸（滴）/ 显色时间 加氢氧化钠 现 象 1 0.5%苯酚 4 4 2 鸡蛋清 4 2 3 指 甲 少 许 8~10 4 头 发 少 许 8~10 5 0.5%色氨酸 4 4 6 0.3%酪氨酸 4 4
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实验三 蛋白质的性质实验（二）蛋白质的沉淀反应
注：实验前将水浴锅的水加热。 一、 目的
1）加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 2）了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 3）了解蛋白质变性与沉淀的关系。 二、 原理
蛋白质在水溶液中是稳定的胶体溶液：1）蛋白质颗粒表面有很多极性基团，与水有很高的亲和性。水易在蛋白质颗粒外形成一层水化膜，使蛋白质颗粒相互分开，避免相互碰撞形成大颗粒而沉淀；2）蛋白质颗粒在非等电点状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，不致聚集而沉淀。因此，在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成稳定的亲水胶体颗粒。在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
蛋白质的沉淀反应可分为两类：
1）可逆的沉淀反应 在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。（等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法等）
2）不可逆沉淀反应 在强烈条件下，破坏蛋白质的水化层或电荷。此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。引起不可逆沉淀的因素：加热、重金属盐、生物碱（如苦味酸、钨酸、鞣酸）以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸)、强酸或强碱等。
蛋白质的变性、沉淀、凝固之间有很密切的关系。但蛋白质变性后并不一定沉淀，变性蛋白质只在等电点附近才沉淀，沉淀的变性蛋白质也不一定凝固。例如，蛋白质被强酸、强碱变性后由于蛋白质颗粒带着大量电荷，故仍溶于强酸或强减之中。但若将强碱和强酸溶液的pH调节到等电点，则变性蛋白质凝集成絮状沉淀物，若将此絮状物加热，则分子间相互盘缠而变成较为坚固的凝块。
因此变性蛋白质并一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质（如可逆性沉淀）也未必都已变性。
三、 试剂与材料
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