生 物 化 学 实 验 讲义

二、材料

干酵母粉。 三、器材

乳钵；容量瓶（10ml），移液管（2.0ml, 5.0ml），量筒（10, 50ml），沸水浴，离心机，布氏漏斗，抽滤瓶，石蕊试纸，滴管等。

五、操作方法

一、酵母RNA提取

称5g干酵母粉置于100ml烧杯中，加入40ml0.2%NaOH溶液，沸水浴上加热30min，经常搅拌。然后加入数滴乙酸溶液使提取液呈酸性（石蕊试纸检查），3000r/min离心15min。取上清液，加入10ml酸性乙醇，边加边搅动。加毕，静置，待RNA沉淀完全后，离心。滤渣先用乙醇洗两次，每次用10ml。再用无水乙醇洗两次，每次10ml，洗涤时间可用细玻璃棒小心搅动沉淀。最后用布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量，计算：

干酵母粉RNA含量(%)＝RNA重（g）?100%干酵母粉重（g）

二、RNA组份鉴定

取2g 提取的核酸，加入1.5M硫酸10ml, 沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。

1．嘌呤碱：取水解液1ml 加入过量浓氨水。然后加入1ml 0.1M硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱地银化合物沉淀。

2．核糖：取水解液1ml， 三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液0.2ml。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变成绿色。

3．磷酸：取水解液1ml，加定磷试剂1ml。在水浴中加热观察溶液是否变成蓝色。 思考题：

1．为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？ 2．如何从酵母中提取到较纯的RNA?

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实验十五、酶的性质

一、实验目的

1.通过本实验观察、验证酶的专一性和温度、pH、激动剂及抑制剂对酶活性的影响。 2.熟悉淀粉及其酶解产物的特殊显色方法；电热恒温水浴的使用。 3.了解唾液淀粉酶的收集与预处理。 二、实验原理

酶具有高度专一性，一种酶只能催化一种或一类底物发生反应，如淀粉酶只能水解淀粉，不能水解蔗糖。当淀粉被淀粉酶彻底水解为还原性麦芽糖和葡萄糖时，能使班氏试剂的Cu2+还原成Cu1+，生成砖红色Cu2O沉淀。淀粉酶的活性受温度、pH、激动剂及抑制剂、酶浓度以及作用时间等多种因素影响，因而水解淀粉生成一系列分子大小不同的糊精。不同程度的水解糊精可与碘反应生成紫色、棕色或红色络合物。通过上述特征性反应，并以蔗糖等作对照，便可观察、验证淀粉酶是否具有专一性以及它的催化活性是否受到影响。 三、试剂和器材 （一）、器材

1、滴管、烧杯、试管（架）及试管夹 。 2、恒温水浴箱与水浴锅。 3、脱脂棉、漏斗及纱布。 4、白瓷反应盘 （二）试剂

1、1％淀粉 称取淀粉1g，加少量水调成糊状，加入煮沸的0.3％NaCl溶液至100m1。 2、1％蔗糖溶液

3、班氏试剂 A液：取柠檬酸钠173ｇ，无水碳酸钠100ｇ，加水600ml，加热溶解，冷却后稀释至850ml；B液：取结晶硫酸铜（CuSO4·5H2O）17.3ｇ溶于100ml预热的蒸馏水中，冷却后加水至150ml。将A液缓慢倒入B液中混匀置试剂瓶备用。

4、碘液：称取碘4g、碘化钾6g溶于l000ml蒸馏水中，置棕色瓶内贮存备用。 5、各种pH缓冲液

（1）pH6.8缓冲液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液772ml，0.1mol/L柠檬酸溶液228ml混合即成。 （2） pH4.0缓冲液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液385.5ml，0.1mol/L柠檬酸溶液614.5ml混合即成。

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（3）pH8.0缓冲液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液972ml，0.1mol/L柠檬酸溶液28ml混合即成。

6、0.9％ NaCl 溶液 7、1％CuSO4 溶液 8、1％Na2SO4溶液 四、操作步骤

（一）、唾液淀粉酶的收集与处理 1.制备唾液

实验者先将痰咳尽，用自来水漱口，以清除口腔内食物残渣，再在口腔内含蒸馏水约15ml，并作咀嚼咕漱运动，3分钟后吐入垫有两层经润湿处理的脱脂纱布的漏斗内，过滤于小烧杯中备用，为与下面稀释唾液相区别，此称制备唾液。 2.煮沸唾液

取上述唾液约2ml，盛入1中号试管中,置沸水浴煮沸5分钟备用。 3.稀释唾液

调整唾液淀粉酶活性，使之在pH6.8、37℃和既无激动剂又无抑制剂条件下，作用5min，水解淀粉至红色糊精为宜。具体做法是取12凹白瓷反应板一块，按下列步骤操作： ①第1排每凹各加1滴制备唾液，12、13、14凹分别加生理盐水1、2、3滴，用滴管采用抽吸法，由稀到浓（14→12）小心混匀各凹，勿使溅入相邻凹中。每混匀一凹便取其1滴放入同列的2排凹中，剩余稀释唾液应全部放回原凹中。

②在盛有不同稀释度唾液的第2排各凹中，均加入4滴缓冲液（pH6.8），2滴1%的淀粉液和2滴蒸馏水，用①混匀法充分混匀，置37℃下5min。

③在第2排各凹中加I液一滴，混匀，观察比较各凹颜色，以浅棕-红色对应的稀释倍数，用生理盐水稀释3ml制备唾液备用。

（二）唾液淀粉酶的专一性以及温度、pH、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活性影响的观察 1、取试管3支编号，按下表1操作

表1 唾液淀粉酶专一性的实验观察

试剂 试管

1 2 3

pH6.8缓冲液 1％淀粉溶液

20滴 20滴 20滴

10滴 10滴 －

1％蔗糖溶液 制备唾液

－ － 10滴

5滴 － 5滴

煮沸唾液

－ 5滴 －

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将上述各管混匀后，置37℃水浴中保温10分钟，然后每管加入班氏试剂20滴，再放入沸水浴中煮沸约15分钟，观察各管颜色反应，并说明原因。

（三）温度影响酶促反应的实验观察 1.取试管3支编号，按下表2操作：

表2 温度影响酶促反应的实验观察

管号 试剂 1.pH6.8缓冲液 2.1％淀粉溶液 3.预热5min 4.直接加入稀释唾液，立即混匀、计时 5.保温10min 1 20滴 10滴 37℃水浴 5滴 37℃水浴 2 20滴 10滴 沸水浴 5滴 沸水浴 3 20滴 10滴 冰浴 5滴 冰浴 2.将一、二管移入冰水浴中，待各管温度一致后速向各管加入碘液1滴，混匀后观察各管颜色的区别，并说明温度对酶促反应的影响。

（四）、pH影响酶促反应的实验观察 1. 取试管3支编号，按下表3操作：

表3 pH影响酶促反应的实验观察

试管1 试管2 试管3

pH4.0缓冲液 pH6.8缓冲液 pH8.0缓冲液

20滴 － －

－ 20滴 －

－ － 20滴

1％淀粉溶液 稀释唾液

10滴 10滴 10滴

5滴 5滴 5滴

2.将上述各管混匀后，置37℃水浴中保温10分钟，然后每管加入碘液1滴，混匀后观察各管颜色的区别，并说明pH对酶促反应的影响。

（五）、激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察 1. 取试管4支编号，按下操作：

表4 激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察

管号 1

pH 6.8 缓冲液 20滴

1％淀粉溶液 10滴

蒸馏水 10滴

0.9％NaCl －

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1％ CuSO4 －

1％Na2SO4 －

稀释唾液 5滴