生 物 化 学 实 验 讲义
表1 DNA标准曲线制作
管号 1，2 3，4 5，6 7，8 9，10 11，12
DNA标准溶液（mL） H2O（mL）
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0
二苯胺试剂（mL） 4 4 4 4 4 4
DNA含量（μg）
0 80 160 240 320 400
按上表加完各试剂后，充分混匀。于60℃水浴中保温1h，冷却后于595nm波长处以1，2管为空白调零，测定各管光密度（OD595nm）。取两管的平均值，以DNA的含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。
2． 样品DNA含量测定：取2支干净试管按表2加入试剂，其它操作同上。
表2 样品DNA含量测定
管号 1’ 2’
*
DNA待测溶液（mL）
2 2
*
二苯胺试剂（mL） 4 4
OD595nm
DNA含量（μg）
待测溶液中的DNA含量应调整至标准曲线的可读范围内。
3． DNA含量计算：以样品的光密度，从标准曲线上查出相对应DNA含量，按下式计算出样品中DNA的百分含量。
DNA（%）=
待测液中测得的DNA量（μg） 待测液中样品的量（μg）
×100
附 注：二苯胺试剂具有腐蚀性，且二苯胺反应产生的蓝色不易褪色，操作中应防止洒出，比色时，比色杯外面一定要擦干净。
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实验十三、定磷法测定核酸的含量
一、实验目的
掌握定磷法测定核酸含量的原理和方法 二、实验原理
核酸分子结构中含有一定比例的磷(RNA含磷量约为8.5%~9.0%，DNA含磷量约为9.2%)，测定其含磷量即可求出核酸的量。
核酸分子中的有机磷经强酸消化后形成无机磷，在酸性条件下,无机磷与钼酸铵结合形成黄色磷钼酸铵沉淀，其反应为：
在还原剂存在的情况下,黄色物质变成蓝黑色,称为钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅与磷含量成正比，可用比色法测定。若样品中尚含有无机磷，需作对照测定，消除无机磷的影响，以提高准确性。 三、实验材料 1.实验器材
恒温水浴,721分光光度计 2.实验试剂
（1）标准磷溶液：将磷酸二氢钾于110℃烘至恒重，准确称取0.8775g溶于少量蒸馏水中，转移至500ml容量瓶中，加入5ml
5mol／L硫酸溶液及氯仿数滴，用蒸馏水稀释至刻度。此溶液每1m1含磷400µg，临用时准确稀释20倍(20µg／m1)。 （2）定磷试剂
① 17％硫酸：17m1浓硫酸(相对密度l.84)缓缓加入到83m1水中。 ②2.5％钼酸铵溶液：2.5g钼酸铵溶于100ml水。
③10％抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100ml水，并贮存于棕色瓶中，溶液呈淡黄色尚可使用，呈深黄甚至棕色即失效。
临用时将上述三种溶液与水按如下比例混合：溶液(1):溶液(2): 溶液(3):水=1:1:1:2(V: V) （3）5%氨水, 27%硫酸 四、实验步骤 1．磷标准曲线的绘制
取干燥试管7支编号，按表所示加入试剂。
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试剂 管号 0
1 0.05 2.95 3.0
2 0.10 2.90 3.0
3 0.20 2.80 3.0
4 0.30 2.70 3.0
5 0.40 2.60 3.0
6 0.50 2.50 3.0
磷标准液，ml 0.00 蒸馏水，ml 3.00 定磷试剂，ml 3.0 A660nm
加毕摇匀，在45℃水浴中保温10min，冷却，以零号管调零点，于660nm处测吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图。 2．总磷的测定
称粗核酸0.1g，用少量水溶解(若不溶，可滴加5%氨水至pH7.0)，待全部溶解后，移至50ml容量瓶中，加水至刻度(此溶液含样品2mg/m1)，即配成核酸溶液。
吸取上述核酸溶液1.0ml，置大试管中，加入2.5m1 27%硫酸及一粒玻璃珠，于通风橱内直火加热至溶液透明(切勿烧干)，表示消化完成。冷却后取下，将消化液移入100ml容量瓶中，以少量蒸馏水洗涤试管两次，洗涤液一并倒入容量瓶，再加蒸溜水至刻度，混匀后吸取3m1溶液置试管中，加3m1定磷试剂，45℃水浴保温10min后取出, 测A660。 3．无机磷的测定
吸取核酸溶液1ml，置于100ml容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取3.0ml置试管中，加定磷试剂3.0m1，45℃水浴中保温10min后取出, 测A660。 4．结果处理
总磷A660－无机磷A660=有机磷A660
从标准曲线上查出有机磷微克数(X)，按下式计算样品中核酸百分含量
X 测定时取样ml数 核酸（%）= 样品重量（μg）
五、实验结果讨论
定磷法即可以测定DNA的含量又可以测定RNA的含量，若DNA中混有RNA或RNA中混有DNA，都会影响结果的准确性。
×稀释倍数×11 ×100%
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实验十四 酵母核糖核酸（RNA）的提取及组分鉴定
一、实验目的
了解并掌握稀释碱法提取RNA及地衣酚显色法测定RNA含量的基本原理和具体方法。 二、实验原理
由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。
稀碱法使用稀碱（本实验用0.2%NaOH溶液）使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。
酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。
RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。 三、试剂和器材 一、试剂
0.04MNaOH溶液；95%乙醇；无水乙醇；乙醚；1.5M硫酸；浓氨水；0.1M硝酸银; 酸性乙醇溶液，30ml乙醇加0.3ml HCl;
三氯化铁浓盐溶液，将2ml 10％三氯化铁（FeCl3· 6H2O）溶液加入400ml浓HCl; 苔黑酚乙醇溶液，称取6g 苔黑酚溶于95％乙醇100ml; 定磷试剂：
17％硫酸：将17ml浓硫酸（比重1084）缓缓倾入83ml水中； 2.5％鉬酸铵：2.5g 鉬酸铵溶于100ml水中；
10％抗坏血酸溶液：10g 抗坏血酸溶于100ml 水，棕色并保存溶液； 临用时将三种溶液和水按下列比例混合：
17％硫酸：2.5％鉬酸铵：10％抗坏血酸：水＝1：1：1：2（V/V）
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