然后在该序列5’端上添加数个碱基作为保护碱基。点击完成。 △下游引物设计相同，不再赘述。

2.突变引物绘制：在目的基因上截取一小段包含要突变位点的序列，点击

Primers→Add primers，为该引物命名，在5’序列突变位点的三个碱基画黑，如图：

点击Insertions，选择突变成的氨基酸，点击Insert。即可获得该突变引物，点击Reverse Complement，可获得反向引物。 六、模拟标准限制性克隆

1.打开被插入片段的质粒图谱，选择合适的两个酶切位点，如HindIII和ApaI，如图：

点击Actions→Insert Fragment，点击HindIII+键盘Shift键+ApaI，点击Insert，在source of fragment处选择插入的目的片段来源。点击上述同样的酶，给该重组质粒命名，点击clone。 七、 模拟融合克隆

1. 打开一个需要插入片段质粒图谱，点击Actions→Insert One Fragments，弹出以下窗口：

2. 点击sequence，找到想要发生替换的位点。

3. 点击Fragment，在Source of Fragment处选择替换片段的另外一个质粒图谱。此时弹出另外一个质粒图谱图样。

4. 点击用于替换的片段，观察该片段阅读方向与被替换质粒位点的方向是否一致，如不一致，点击

更换方向。

5. 选择后，点击Product，点击Choose Overlapping PCR Primers，此时即形成融合后的质粒图谱。

6.若想获得引物的序列，点击Primers→Export Selected Primers，选择保存。