第八章 生物抗氧化成分的测定
第一节 SOD(超氧化物歧化酶）活力和含量的测定
一、SOD活力的测定（邻苯三酚氧化法）
1.原理
利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O，生成带色的中间产物。
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反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min。加入SOD酶液则抑制其氧化速度，在325nm处测定溶液的吸光量。酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量为一个活力单位。
2.仪器及试剂
（1）UV-260自动紫外光分光光度计（或其他型号）。
（2）pH8.2、50mmol/L Tris - HCl缓冲液 50mL 50mmol/L Tris加20mL 50mmol/L HCl，用水稀释至100mL，调pH至8.20。
（3）50mmol/L KH2PO4-NaOH缓冲液 5mL0.2mol/L KH2PO4-NaOH加4.5mL0.2mol/L NaOH，用水稀释至20mL，调pH至7.8。
（4）50mmol/L邻苯三酚溶液 用10mmol/L HCl配制。 3.测定步骤
样品液制备：称取5.0g鲜样，加10mL50mmol/L pH7.8磷酸盐缓冲液，匀浆，过滤，滤液置透析袋内，于5~7℃冰箱内动态透析6~8h（亦可每小时换透析液一次，透析液为pH7.8磷酸盐缓冲液）。若样品为溶液，可直接加pH7.8磷酸盐缓冲液透析。
邻苯三酚自氧化速率的测定：在室温下（20~22℃），取5mL 50mmol/L pH8.2 Tris-HCl缓冲液，加5μL 50mmol/L邻苯三酚，摇匀，在325nm下，1cm比色皿，以pH8.2 Tris-HCl缓冲液为空白，立即测定吸光度，并每隔0.5min测定一次，自氧化速率控制在每分钟0.060~0.065（一般测定4min，求得每分钟平均变化率）。
样品中SOD测定：取5mL 50mmol/L pH8.2 pH8.2 Tris-HCl缓冲液，加待测样品透析液5~20μL ，加5μL 50mmol/L邻苯三酚，摇匀，立即同上测定。
4.计算
V0?V1nSOD活力(u/mL)??V?
V0?50%V'式中 V0——自氧化速率吸光度； V1——样液速率吸光度； n——稀释倍数；
V——反应液总体积（mL）； V'——样液总体积（mL）；
二、SOD活力的测定（化学发光法）
1. 原理
黄嘌呤氧化酶在有氧条件下催化底物黄嘌呤或次黄嘌呤氧化生成尿酸的同时产生O·，O·与化学发光剂鲁米诺（氨基苯二酰肼）反应生成激发态的中间物，当
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中间物返回基态时，以光辐射的能量产生发光现象，由于SOD能清除O·,所以抑
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制鲁米诺的化学发光，其抑制程度与酶活力大小有关。
2. 仪器及试剂
（1）生物化学发光仪。 （2）0.05mol/L 碳酸盐缓冲液（含0.1mmol/L EDTA-Na2，pH10.2）称取Na2CO3 3.68g，NaHCO3 1.28g，EDTA-Na2 37.22mg，用水溶解并稀释至1000mL，4℃储存1~2月。
（3）0.05mol/L磷酸盐缓冲液（含0.1mmol/L EDTA-Na2，pH7.8）称取K2HPO4 7.970g，KH2PO4 0.579g，EDTA-Na2 37.22mg，用水溶解并稀释至1000mL，室温放置1周。
（4）0.1mmol/L 黄嘌呤（Xanthine） 黄嘌呤3.8mg加0.05mol/L碳酸盐缓冲液至250mL，新鲜配制。
（5）0.1mmol/L 鲁米诺（Luminol） 鲁米诺4.45mg加0.05mol/L碳酸盐缓冲液至250mL，新鲜配制黄嘌呤-鲁米诺混合液（1+1），用前新鲜配制。
（6）黄嘌呤氧化酶（0.1mg/mL） 黄嘌呤氧化酶（46mg/mL）22μL加入
0.05mol/L磷酸盐缓冲液10mL，用前新鲜配制（黄嘌呤氧化酶也可根据酶活性大小配成适当浓度，以在发光仪空白300~400mV的读数为宜）。
（7）超氧化物歧化酶标准品。 3. 测定步骤
SOD标准曲线的绘制：将标准品SOD用0.05mol/L磷酸盐缓冲液稀释成2，4，6，8，10ng/mL，取不同浓度SOD液10μL，加黄嘌呤氧化酶10μL，再加鲁米诺-黄嘌呤混合液980μL，测定反应1min后6s的发光值（mV），空白对照用0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.8）10μL代替，以空白对照的发光强度为100%，抑制发光程度为纵坐标，SOD浓度为横坐标，绘制标准曲线，求出抑制50%发光程度时SOD的浓度C50（mg/mL）。
样品测定：取血样10μL，加入到0.5mL水中，充分振摇使之溶血（1+50）。试剂添加量如表2-8-1所示。
表2-8-1 样品测定时试剂添加量 试剂/μL 溶血液量 0.05mol/L磷酸盐缓冲液量 样品管 10 10 空白管 黄嘌呤氧化酶量 鲁米诺-黄嘌呤混合液量 样品管 10 980 空白管 10 980 按上表顺序加样，混匀后立即计时，测1min后6s的发光值（mV）或积分值。 4. 计算
在25℃条件下，抑制50%发光程度时所需的SOD浓度ρ50（ng/mL）为1个酶活力单位。
A0?A1发光抑制率（%）??100
A0式中 A0——空白发光值（mV）； A1——样品发光值（mV）。
根据发光抑制率在标准曲线上查出样品的SOD含量（ng/mL）
SOD活力（u/mL全血）??样品SOD含量（ng/mL）?样品稀释倍数标准品SODρ50（ng/mL） 实测样品发光抑制率%?样品稀释倍数（5000）50%
5. 讨论
（1）溶血液及黄嘌呤氧化酶的加样量可根据酶活性大小调整，但每次试验各组加样量要一致，最终反应体积为1mL，可在加混合液前用水补齐。
（2）SOD活力测定方法灵敏度的高低取决于pH和O·稳态浓度（即黄嘌呤
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氧化酶的量）。
三、SOD活力和含量的测定（羟胺法）
1. 原理
O·氧化羟基的最终产物为亚硝酸盐，后者在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈
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现紫红色，在波长530nm处有最大吸收峰，可用分光光度法进行测定，当SOD消除O·后形成的亚硝酸盐减少。
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2. 试剂
（1）1/15mol/L磷酸盐缓冲液pH 7.8。 （2）10mmol/L盐酸羟胺。
（3）7.5mmol/L黄嘌呤 黄嘌呤11.41mg，加水至10mL。 （4）0.023u/mL黄嘌呤氧化酶 取25u/0.9mL的黄嘌呤氧化酶8.4μL加pH 7.8磷酸盐缓冲液至10mL。
（5）10g/L甲萘胺；3.3g/L对氨基苯磺酸；3g/L磺基水杨酸。 （6）SOD标准品。
3. 测定步骤
红细胞抽提液制备：50μL全血冲入0.5mL生理盐水，2000r/min离心3min，弃上清液，加冰冷的水0.2mL，混匀，加入95%乙醇0.1mL，振荡30s，加入三氯甲烷0.1mL，置快速混合器抽提1min。4000r/min离心3min，分层，上层为SOD抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯甲烷，记录上清液体积待测。
组织匀浆的制备：剪取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，至玻璃匀浆器中加入冷生理盐水20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行三次，制成10%组织匀浆（最好用超声波发生器处理30s），使线粒体振破，以中性红-詹钠氏绿B染色证明线粒体已振破，以4000r/min离心5min，取上清液20μL待测。
样品测定如表2-8-2所示。
表2-8-2 羟胺法测定SOD活力 单位：mL
试剂 1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.8） 样品液 10mmol/L盐酸羟胺 7.5mmol/L黄嘌呤 0.023u/mL黄嘌呤氧化酶 双蒸水 混匀，37℃恒温水浴30min
3.3g/L对氨基苯磺酸 10g/L甲萘胺 2.0 2.0 2.0 2.0 测定管 1.0 A* 0.1 0.1 0.1 0.5 对照管 1.0 0.1 0.1 0.1 0.5 A*为所用样品的量，红细胞抽提液5~10μL；血清（或血浆）20μL；组织匀浆5~10μL。 混匀15min后，倒入1cm比色杯，以蒸馏水调零，530nm处比色测定吸光度。
SOD标准抑制曲线：将SOD标准品用磷酸盐缓冲液配制成750u/mL的溶液，再稀释到50倍，即SOD量为15u/mL（1.15μg/mL），用本法测定不同量的SOD标准液的百分抑制率，以百分抑制率为纵坐标，以SOD活力单位u/min为横坐标绘制标准曲线。
A1?A2SOD抑制率（%）??100
A1式中 A1——对照管吸光度； A2——测定管吸光度。
4. 计算
每1mL反应液SOD抑制率达50%时所对应的SOD的酶量为一个活力单位。
（A1?A2）?100%VSOD活力（u/mL）???n
50%?A1V'式中 A1——对照管吸光度；
A2——测定管吸光度；
V——反应液总量（mL）； n——样品稀释倍数； V'——取液量（mL）。
也可用酶比活力即每管样品的百分抑制率从SOD标准曲线查出相应的SODu/mL，乘以稀释倍数（1mL/取样量）。
若样品为组织匀浆，根据匀浆浓度或组织蛋白质含量，将单位换算为u/g组织或u/mg蛋白。
第二节、谷胱苷胺肽过氧化物酶活力测定
1. 原理