⑴FDNB与之反应再酸水解后得DNP-Ala

⑵胰凝乳蛋白酶（CT）消化后，从产物中分出一个纯四肽，其组成为：Asp1，Gly1，Lys1，Met1，此四肽的FDNB反应降解产物为DNP-Gly

⑶胰蛋白酶（T）消化八肽后又可得到组成分别为Lys1，Ala1，Ser1及Phe1，Lys1，Gly1的两个三肽及一个二肽。此二肽被CNBr处理后游离出自由天冬氨酸。 请列出八肽全顺序并简示你推知的过程。

4.某天然九肽其组成为：Gly2，Phe2，Tyr1，Met1，Asp1，Arg1和Pro1，经胰凝乳蛋白酶（CT）水解后可分得一个五肽和一个四肽，四肽的组成为：Phe1，Tyr1，Gly1和Pro1。此九肽的CNBr处理产物再经阳离子交换树脂层析并洗脱得一个组成为Arg1，Phe1和Gly1的三肽，此九肽如经胰蛋白酶（T）水解可得Phe，如用FDNB反应后再水解测得DNP-Tyr。请写出这九肽的全顺序解析过程。

5.已知一个九肽的氨基酸顺序是：Ala-Pro-lys-Arg-Val-Tyr-Glu-Pro-Gly，在实验室只有氨基酸分析仪，而没有氨基酸顺序测定仪的情况下，如何使用（1）羧肽酶A或B；（2）氨肽酶；（3）2，4二硝基氟苯（FDNB）；（4）胰蛋白酶；（5）胰凝乳蛋白酶，来验证上述肽段的氨基酸顺序。

6.比较肌红蛋白和血红蛋白的氧合曲线，并加以简单的说明。

7.大肠杆菌含有2000种以上的蛋白质，为了分离它所表达的一个外源基因的产物并保持它的活性，常有很大困难。但为了某种目的，请根据下列要求写出具体的方法。

⑴利用溶解度差别进行分离。 ⑵利用蛋白质分子大小进行分离。 ⑶根据不同电荷进行分离。

⑷以制备有该产物的抗体进行分离。 ⑸产物的浓缩。 ⑹纯度的鉴定。

8.蛋白质变性过程中，有那些现象出现？并举出三种能引起蛋白质变性的试剂。 9.举一个例子来说明蛋白质三级结构决定于它的氨基酸顺序？ 10．用什么试剂可将胰岛素链间的二硫键打开与还原？如果要打开牛胰岛素核酸酶链内的二硫键，则在反应体系中还必须加入什么试剂？蛋白质变性时，为防止生成的-SH基重新被氧化，可加入什么试剂来保护？ 11.要测定蛋白质的二硫键位置，需用什么方法？请简述之。

12.简述White和Anfinsen进行的牛胰核糖核酸酶（Rnase）变性和复性的经典实验。这个实验说明了什么问题？ 13.有一条多肽链-Ｐro-Ｐhe-Ｃys-Ｌys-Ｔyr-Ｖal-Ａla-Ｓer-Ｈis-，如用胰蛋白酶水解可得几条肽段？用胰凝乳蛋白酶水解呢？

14.简述胰岛素原的激活过程？

15.一个五肽，经完全水解后得到等摩尔数的Ala、Cys、Lys、Ser、Phe，用苯异硫氰酸（异硫氰酸苯酯）处理后得到PTH-Ser，用胰蛋白酶水解得一个N-末端为Cys的三肽和一个二肽，用胰凝乳蛋白酶水解此三肽得一个Ala及一个二肽，问：

⑴胰蛋白酶水解后得到的三肽的氨基酸组成及顺序？ ⑵胰蛋白酶水解后得到的二肽的氨基酸组成？ ⑶此五肽的一级结构？

16.试计算丙氨酸（PKα-COOH=2.34，PKα-NH3=9.69），谷氨酸（PKα-COOH=2.19，PKα-NH3=9.67，PKR-COOH=4.25）的等电点。

17.把Ser、Ile、Glu、Ala的混合物在含有正丁醇、水和乙酸的溶剂系统中进行单向纸层析，请写出层析的快慢顺序。 18.某蛋白质多肽链有一些区段为α-螺旋构象，另一些区段为β-折叠构象，该蛋白质分子量为240Kda，多肽外形总长为5.06×10-5cm，计算多肽链中α-螺旋构象占分子长度的百分之多少？

19.球状蛋白质在pH7的水溶液中折叠成一定空间构象。这时通常非极性氨基酸残基侧链位于分子内部形成疏水核，极性氨基酸残基位于分子表面形成亲水面。问：

⑴Val、Pro、Phe、Asp、Lys、Ile和His中哪些氨基酸侧链位于分子内部？哪些氨基酸侧链位于分子外部？ ⑵Ser、Thr、Asn和Gln虽然是极性氨基酸，但它们常常位于球状蛋白质的分子内部，为什么？ 20.多肽链片段是在疏水环境中还是在亲水环境中更利于α-螺旋的形成？为什么？

第一章：蛋白质的结构与功能参考答案

一、名词解释 1.构象：在分子中由于共价单键的旋转所表现出的原子或基团的不同空间排布叫构象。构象的改变不涉及共价健的断裂和重新组成，也没有光学活性的变化，构象形式有无数种。

5

2.构型：在立体异构体中原子或取代基团的空间排列关系叫构型。构型不同的分子在立体化学形式上能够区分。构型有两种，即D-型和L-型。构型的改变要有共价键的断裂和重新组成，从而导致光学活性的变化。

3.氨基酸的等电点：当溶液在某一特定的pH时，氨基酸主要以两性离子形式存在，净电荷为零，在电场中不发生移动，此溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。

4.二面角：在多肽链里，Cα碳原子刚好位于互相连接的两个肽平面的交线上。Cα碳原子上的Cα-N和C-C都是单键。可以绕键轴旋转，其中以Cα—N旋转的角度称为Φ，而以C-C旋转的角度称为Ψ，这就是α-碳原子上的一对二面角。它决定了由α-碳原子连接的两个肽单位的相对位置。

5.肽单位：肽链主链上的重复结构，如Cαα-CO-NH-Cαα，称为肽单位或肽单元，每个肽单位实际上就是一个肽平面。 6.蛋白质一级结构：由氨基酸在多肽链中的数目、类型和顺序所描述的多肽链的基本结构。它排除了除氨基酸α-碳原子的的构型以外的原子空间排列，同样的也排除了二硫键，所以不等于分子的共价结构。

7.蛋白质二级结构：指多肽链主链在一级结构的基础上进一步的盘旋或折叠，从而形成有规律的构象，如α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规卷曲等，这些结构又称为主链构象的结构单元。维系二级结构的力是氢键。二级结构不涉及氨基酸残基的侧链构象。

8.蛋白质三级结构：指一条多肽链在二级结构（超二级结构及结构域）的基础上，进一步的盘绕、折叠，从而产生特定的空间结构或者说三级结构是指多肽链中所有原子的空间排布。维系三级结构的的力有疏水作用力、氢键、范德华力、盐键（静电作用力）。另外二硫键在某些蛋白质中也起非常重要的作用。

9.蛋白质四级结构：有许多蛋白质是由两个或两个以上的具有独立三级结构的亚基通过一些非共价键结合成为多聚体，这些亚基的结构是可以相同的，也可以是不同的。四级结构指亚基的种类、数目及各个亚基在寡聚蛋白中的空间排布和亚基之间的相互作用。维系四级结构的力有疏水作用力、氢键、范德华力、盐键（静电作用力）。

10.超二级结构：在球状蛋白质分子的一级结构顺序上，相邻的二级结构常常在三维折叠中相互靠近，彼此作用，在局部区域形成规则的二级结构的聚合体，就是超二级结构。常见的超二级结构有（αα）(βββ)(βαβ)等三种组合形式，另外还有（βαβαβ）和（βcβ）结构也可见到。在此基础上，多肽链可折叠成球状的三级结构。（βcβ）结构中的c代表无规卷曲。

11.结构域：在较大的蛋白质分子里，多肽链的三维折叠常常形成两个或多个松散连接的近似球状的三维实体，这些实体就称为结构域，例如免疫球蛋白就含有12个结构域，重链上有四个结构域，氢链上有两个结构域。结构域是大球蛋白分子三级结构的折叠单位。

12.蛋白质的等电点：当溶液在某个pH时，蛋白质分子所带正电荷数与负电荷数恰好相等，即净电荷为零，在直流电场中，既不向阳极移动，也不向阴极移动，此时溶液的pH就是该蛋白质的等电点。

13.盐溶：在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，如硫酸铵等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大，这种现象称为盐溶。

14.蛋白质的变性作用:天然蛋白质分子受到某些物理、化学因素，如热、声、光、压、有机溶剂、酸、碱、脲、胍等的影响，生物活性丧失，溶解度下降，物理化学常数发生变化。这种过程称为蛋白质的变性作用，蛋白质变性作用的实质，就是蛋白质分子中次级键的破坏，而引起的天然构象被破坏，使有序的结构变成无序的分子形式。蛋白质的变性作用只是三维构象的改变，而不涉及一级结构的改变。

15.蛋白质的复性:变性蛋白质在一定的条件下可以重建其天然构象，恢复其生物活性，这种现象称为蛋白质的复性。 16.盐析:高浓度的中性盐类，如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，可以脱去蛋白质分子的水膜，同时，中和蛋白质分子的电荷，从而使蛋白质从溶液中沉淀下来，这种现象称为盐析。

17.蛋白质的变构效应:在寡聚蛋白分子中，一个亚基，由于与配体的结合，而发生的构象变化，引起相邻其它亚基与配体结合的能力亦发生改变。这种效应称为蛋白质的变构效应。

18.沉降系数:一种蛋白质分子在单位离心力场里的沉降速度为恒定值，被称为沉降常数或沉降系数，常用S表示。 19.电泳:在直流电场中，带正电荷的蛋白质分子向阴极移动，带负电荷的蛋白质分子向阳极移动，这种移动现象，称为电泳。

20.偶极离子:在同一个氨基酸分子上含有等量的正负两种电荷，由于正负电荷相互中和而呈电中性，这种形式称为偶极离子。 二、填空题

1. 2，4二硝基氟苯/FDNB、丹磺酰氯/DNS-Cl、异硫氰酸苯酯/PITC、氨肽酶、肼解、羧肽酶 2. αα、βαβ、βββ

3.蛋白水解酶酶解、对角线电泳 4.色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、280

5.酸性、碱性、Asp、Glu、Arg、Lys、His 6. 16%

7.两性、负电

8.酸、碱、6.02、阳

6

9.二、不相同、均一亚基或一条肽链 10.化学合成、牛胰岛素 11.20、甘氨酸、氨基、羧基

12. 中心轴、N-H、C=O、肽平面上的H与O 13. Cys、Gly 14. 电荷、水化膜 15. 球状、纤维状 16.Lys、Arg

17.羟基、羧基、巯基 18.②、①、③、④ 19.3.6、0.54nm、0.15nm 20．协同、变构 21．右

22．肽键、二硫键、氢键、疏水作用力、离子键、范德华力 23．Edman、PITC、PTC-aa、PTH-aa

24．α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲 25．疏水作用力

26．沉降速度法、凝胶过滤法、电泳法

27．谷光甘肽、谷aa、半胱氨酸、甘氨酸、肽、巯基 28．Sanger、Sanger、胰岛素、二、30、21、三、二硫 29．二、氢键、30、72

30．（NH4）2SO4、NaCl、Na2SO4 三、选择题

1.A 2.B 3.C 4.C 5.C 6.B 7.D 8.A 9.A 10.B 11.C 12.B 13.C 14.B 15.A 16.D 17.D 18.D 19.B 20.C 21.D 22.A 23.D 24.A 25.D 26.C 27.D 28.B 29.D 30.B 31.D 32.B 33.C 34.D 35.D 36.D 37.B 四、是非题

1.错 2.错 3.对 4.对 5.对 6.错 7.对 8.错 9.错 10.对

11.对 12.对 13.错 14.对 15.错 16.对 17.对 18.错 19.对 20.错 21.错 22.对 23.错

24.对 25.错 26.错 27.对 28.错 29.对 30.错 31.对 32.对 33.对 34.错 35.错 36.错 五、问答题

1. 血红蛋白含有2个α亚基和2个β亚基，每个亚基均有一个血红素。每个血红素都可以和一个氧分子结合。但是4个亚基和氧分子的结合能力有所不同。每一个亚基和氧分子结合后，这个亚基发生构象改变，使得其他亚基和氧分子结合更容易，呈现亚基间的协同效应。除了亚基间的协同效应可影响亚基和氧的结合，氢离子和二氧化碳可以促进和血红蛋白结合的氧分子的释放，即所谓‘波尔效应’。2，3-二羟基甘油磷酸和亚基结合后也可以抑制血红蛋白和氧的结合。

2. 此肽段的序列为：酪氨酰-精氨酰-甲硫氨酰-脯氨酸。确定脯氨酸残基存在的依据是与茚三酮反映呈黄色。 3. 由结果⑴可得知此肽的N端是Ala；由结果⑵可知C端四肽的序列是Gly-Lys-Met-Asp；由结果⑶可知N端的三肽序列为Ala-Ser-Lys，中间的肽段序列为Phe-Gly-Lys，二肽被CNBr处理后游离出自由天冬氨酸，这提示了这二肽的序列为Met-Asp，而且没有碱性残基，因此是整个肽链的C端二肽。完整的八肽序列为：Ala-Ser-Lys-Phe-Gly-Lys-Met-Asp。 T ↓CT↓ T ↓

Ala-Ser-Lys-Phe-Gly-Lys-Met-Asp

DNP-Ala DNP-Gly

4.该九肽序列为：Tyr-Pro-Gly-Phe-Asp-Met-Gly-Arg-Phe CT↓ CNBr↓ T ↓

Tyr-Pro-Gly-Phe-Asp-Met-Gly-Arg-Phe

DNP-Tyr

通常Pro的存在有可能影响蛋白水解酶对附近肽键的作用，因此，更可能的序列是Pro-Gly而不是Gly-Pro。

5. 用两种羧肽酶和氨肽酶作用此九肽，都不能释放出氨基酸，证明了第2位和第八位的残基均为脯氨酸；用FDNB可以测得该肽的N末端为Ala，用胰蛋白酶作用可得到Ala，Pro，Lys组成的三肽，这表明了第三位的残基为Lys；同时得到一段五肽和游离的Arg，这提示了Arg是第四位的残基。用胰凝乳蛋白酶作用后，可得到一段六肽和一段三肽，

7

同时也确认了第六位残基是带芳香性侧链的Tyr。由六肽的氨基酸组成测得，确定其中含有Val，很自然的可认定这残基应是第五位的残基。用FDNB证明了酶解后所得三肽的N末端，即九肽的第七位残基，是Glu后，九肽的C末端也肯定是Gly。

6. 肌红蛋白和血红蛋白的氧合曲线的差别是：前者是双曲线形式，后者是S型曲线。原因是肌红蛋白是单个亚基的氧结合蛋白，不存在协同效应；而血红蛋白是含有4个亚基的氧结合蛋白，彼此间存在着协同效应。可参阅主要参考书（1）上册184-188页。

7. 首先要有一种或几种检测或鉴定外源基因表达产物的方法，然后，在每一次分离纯化后检测表达产物存在哪一个级分中。⑴用硫酸铵或酒精分级沉淀，可根据蛋白质的溶解度的差别进行分离。⑵SDS-PAGE、凝胶过滤、超离心，以及超滤可对分子量不同的蛋白质进行分离。⑶对带电行为不同的蛋白质可以用离子交换层析、等电聚焦、圆盘电泳、毛细管电泳等方法进行分离；但是在使用这一类型的方法时选择溶液的pH值至关重要，因为蛋白质的带电行为和溶液的pH值密切相关。⑷如果具备表达产物的抗体，则可以使用亲和层析或免疫沉淀的方法简洁的分离所需的表达产物。⑸使用吸附量较大的离子交换层析和亲和层析，以及对饱和硫酸铵或聚乙二醇反透析，还有冷冻干燥等方法都可以达到浓缩样品的目的，然而这些方法使用时，都存在着拖延或除去小分子化合物的问题。相比而言，选用合适截流分子量的超滤膜，进行超过滤，往往能同时达到浓缩样品和去盐（包括小分子）的目的。⑹在上述的（2）和（3）这两大类用于分离纯化产物的过程，实际上也有样品纯度鉴定的作用。此外，末端分析、质谱和反相的HPLC层析也都是有效的样品纯度鉴定的方法。但是应注意，样品的纯度是一个相对的概念。

8．蛋白质的变性过程，通常总是伴随着有序的结构的破坏和生物活性的丧失。有序结构的破坏包括了亚基间的解离、二级和三级结构的改变，多数情况是肽链的松散，原来包埋在内部的残基（主要是疏水性残基）的暴露。活性丧失，除了和配体的结合能力丧失，还有抗原性的改变。

极端的pH、尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂和不同类型的去垢剂都是能引起蛋白质变性的试剂 。

9．蛋白质的一级结构决定蛋白质的高级结构这一原则目前基本上仍是正确的。但是是有条件的。例如同样一条肽链，在存在变性剂的条件下是松散的。现在所说的蛋白质的三级结构取决于它的氨基酸序列是指在生理条件下，蛋白质的一级结构和其三级结构之间的特定的对应关系。典型的例子是牛胰核糖核酸酶的二硫键被还原，肽链松散后，经适当的条件，致使肽链中的二硫键的正确配对，此时肽链仍能呈现具有生物活性的天然构象。当前有相当多的蛋白质工程的例子可以说明，肽链中某些残基的突变可以引起突变蛋白的构象改变。

10．最常用的打开二硫键的方法是使用巯基试剂，例如巯基乙醇，可使参与二硫键的2个半胱氨酸还原为带有游离巯基的半胱氨酸。为了使还原反应能顺利进行，通常加入一些变性剂，如高浓度的尿素等。加入过量的还原剂可以防止还原所得的巯基被重新氧化。如果不准备使肽链重氧化，而是进一步进行结构化学结构的研究，可以将巯基转化为其他的修饰形式，例如和羧甲基化等烷化剂反应。除了已介绍的还原羧甲基化，还有过甲酸氧化法和亚硫酸还原法。

11．测定蛋白质中二硫键的经典方法是对角线电泳。简言之，先是用专一性适中的蛋白质水解酶，将蛋白质降解为若干片段。随后进行二维纸电泳，在第一相电泳用挥发性的还原剂处理，然后进行第二相电泳。经显色后，在多角线上的肽段均不含有二硫键，而偏离对角线的肽段是形成二硫键的肽段，测定有关肽段的氨基酸组成，即能确定蛋白质肽链中二硫键配对的情况。目前利用质谱技术也可以测定二硫键。

12．螺旋中一个残基的C=O与其后第四个氨基酸残基的N-H之间形成氢键。形成的氢键C=O?H-N几乎成一直线。每个氢键的键能虽不强，但是大量的氢键足以维持α-螺旋的稳定性。一圈螺旋3.6个残基，氢键封闭13个原子。α-螺旋是α-系螺旋的一种，α-系螺旋可用下列通式表示：

⑴圈内原子数为3n+4，当n=3时，即为α-螺旋。

⑵由于α-螺旋内原子数为13，从而α-螺旋也写作：3.613。当n=2时，即为3.010螺旋。此螺旋构象不如3.613构象稳定。

13. 胰蛋白酶水解碱性氨基酸羧基端肽键可得2条肽段；胰凝乳蛋白酶水解芳香族氨基酸羧基端肽键可得3条肽链。

14. 胰岛素是在胰岛β-细胞内合成的一种多肽激素。最初合成的是一个比胰岛素分子大一倍多的单肽链，称为前胰岛素原，它是胰岛素原的前体，而胰岛素原又是胰岛素的前体。胰岛素原是前胰岛素原去掉N-末端的信号肽形成的，被运送到高尔基体储存。当机体需要活性胰岛素时，在特异的肽酶作用下，去掉C肽转变为具有活性的胰岛素，这就是胰岛素原被激活的过程。

15. A：用酸解结果表明此五肽由Ala、Cys、Lys、Ser、Phe组成；B：苯异硫氰酸处理得到PTH-Ser，C：胰蛋白酶水解碱性氨基酸羧基端肽键；D：胰凝乳蛋白酶水解芳香族氨基酸羧基端肽键

因此：⑴胰蛋白酶水解得三肽是Cys-Phe-Ala;⑵胰蛋白酶水解得二肽是Ser-Lys; ⑶五肽一级结构 Ser-Lys-Cys-Phe-Ala。

16.pI=0.5（PK1+PK2）；Ala pI=6.02；Glu pI=3.22

17．一般纸层析是根据物质的极性或亲水性的大小来进行分离的。这几种氨基酸的极性大小顺序为Glu>Ser>Ala>Ile，所以它们在纸层析中的快慢顺序为Glu>Ser>Ala>Ile。

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