园艺3031班 11号

Jiang LX, Yang SL, Xie LF, et al. VANGUARD1 encodes a pectin methylesterase that enhances pollen tube growth in the Arabidopsis style and transmitting tract. Plant Cell, 2005, 17: 584-596.

VGD1编码一种促进拟南芥花粉管

在花柱和生殖通道中伸长的果胶甲酯酶

学 生：顾金玲，园艺园林学院 指导教师：刘乐承，园艺园林学院

摘要 在开花植物中，花粉管通过进入柱头、花柱和生殖通道，是将精核传递到深嵌于雌性组织内卵细胞中十分重要的过程。尽管它在植物繁育中很重要，然而人们对控制花粉管通过柱头、花柱和花粉管穿越的分子机制却了解的很少。这里，本文报道了一种拟南芥基因VGD1的鉴别和描述，它是编码一种含有595个氨基酸的类似果胶甲酯酶（PME）的蛋白质，该蛋白具有促进花柱中花粉管和生殖通道组织的伸长的作用。VGD1是在花粉粒和花粉管中特异表达的。这种VGD1蛋白在花粉粒和花粉管中普遍存在，原生质膜和细胞壁中也有。VGD1的功能中断会使野生类型花粉粒中PME的活性降低到野生型的82%，同时极大地阻碍了花柱和生殖通道中花粉管的伸长，导致雄性育性的显著降低。此外，与野生型花粉管相比，VGD1花粉管不稳定，在离体培养基中萌发和伸长时往往爆裂。本研究表明VGD1产物可能是通过改善细胞壁和加强花粉管与雌性花柱的相互作用和增强生殖通道组织来促进花粉管伸长的。

前言

开花植物的受精需要将精子传递到卵细胞。这个过程开始于花粉粒在柱头上的积累。花粉和柱头细胞的相互识别作用引发它们的结合和花粉的萌发。最终花粉管进入柱头组织，穿过花柱，通过生殖通道，然后直接进入嵌在胚珠中的花粉母细胞(Hülskamp et al, 1995b; Wihelmi and Preuss, 1996; Ray et al, 1997; Lennon and Lord, 2000; Palanivelu and Preuss, 2000; Johnson and Preuss, 2002; Lord and Russell, 2002; Preuss, 2002; Kim et al, 2003; Palanivelu et al, 2003)。好几个研究表明，组成成分如花粉和柱头上的脂质，对水分从柱头细胞运输到花粉是十分重要的(Elleman et al, 1992; Preuss et al, 1993; Hülskamp 1995a; Wolters-Arts et al, 1998; Zinkl et al, 1999; Fiebig et al,

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2000)。形态学研究也表明，花粉管和柱头细胞间的相互识别作用是引发柱头和花柱细胞壁的降解所需要的(Atkinson et al, 1993; Hiscock et al, 1994; Johnson and Preuss, 2002; Lord and Russell, 2002)。然而，对控制花粉管通过柱头和花柱组织的物质的基因和分子机制了解很少。

在植物物种如百合(Lilium longiflorum)具有中空的柱头和花柱，花粉管和生殖通道表皮的黏和是花粉管伸向胚珠所必须的。据报道，生殖通道表皮分泌的花柱基质在这种黏和中起着很重要的作用（Jauh et al, 1997; Lord, 2000, 2001; Lord and Russell, 2002; Kim et al, 2003; Park and Lord, 2003）。同样地，在物种如拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，有闭合的花柱，生殖通道的内部细胞间全都充满了富含营养的细胞外基质(ECM)。花粉管通过ECM比离体培养时伸长更快、更长和更精确，这表明花粉管和生殖通道ECM的相互作用对花粉管在生殖通道中的移动是非常重要的（Lennon et al, 1998; Lennon and Lord, 2000; Lord, 2000）。然而，尽管它们对精子向卵细胞的转移很重要，但人们对能控制花粉管与雌花组织间相互作用的基本的分子机制却知道的很少。

通过修改细胞壁，果胶甲酯酶（PMEs）被认为在植物发育的不同生理过程中发挥着作用（Bordenave and Goldberg, 1993; Kagan-Zur et al, 1995; Guglielmino et al, 1997; Wakeley et al, 1998; Futamura et al, 2000; Micheli et al, 2000; Ren and Kermode, 2000; Li et al, 2002）。植物的细胞壁是一个聚合的网状系统，该系统是由嵌入在半纤维素和果胶亲水基质中的透明纤维素微纤维组成的（Denes et al, 2000）。PMEs是通过细胞壁果胶的脱甲酯调节细胞壁的机理和化学特性来促进细胞的发育。花粉管机械强度和硬度的改变也被认为对花粉管的伸长和它们与雌花组织的相互作用的过程是重要的（Franklin-Tong et al, 1996; Holdaway-Clarke et al, 1997; Franklin-Tong, 1999）。另外，一些研究已经引出对花粉管特异的PMEs的分离，这表明植物PMEs可能参与了花粉管发育以及它与雌花组织相互作用的过程（Wakeley et al, 1998; Futamura et al, 2000; Li et al, 2002）。然而，花粉管特异的PMEs的真正生物学功能目前还不清楚。这里，本文报道了一种新的拟南芥PME突变体vanguard1(vgd1)的分离和描述，它能显著地阻碍花粉管在花柱和生殖通道中的伸长。VGD1基因编码一种含有595个氨基酸的类似PME蛋白，并且在花粉粒和花粉管中特异表达。这项研究指出，VGD1可能是通过改善细胞壁增强花粉管与雌性花柱和生殖通道的相互作用，从而对花粉管在雌性花组织中的伸长过程起着重要作用。

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结果

vgd1突变体的分离

vgd1突变体是从拟南芥一个育性降低的Landsberg erectal生态型的enhancer-trap-dissociation(Ds)插入系中通过形态筛选而鉴定出来的(Sundaresan et al, 1995)。纯合的vgd1植物(图１A和B)与野生型的植物（图１C和D）相比，vgd1植物产生小而短的长角果，而且种子也很少。在其他花和营养器官中未观察到有形态学的不正常（图１E和F）。

图１ vgd1突变体与野生型的表型比较

(A)有少量种子，瘦小的长角果表明一株vgd1突变体植株的育性降低。 (B)一个vgd1的长角果，表明种子仅在长角果的上端产生。 (C)有饱满种子的长角果表明一个野生型植株有完全可育性 (D)一个有饱满种子的野生型长角果。 (E)一个具有正常花器和花粉粒的vgd1花

(F) 一个具有正常花器和花粉粒的野生型植株的花。

Sd,种子 Bars=1cm在(A)和(C)中，在(B)和(D)到(F)中，Bars=1mm

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vgd1是与一个单Ds插入共分离的一个雄配子突变体

为调查vgd1是影响雄性还是雌性器官的功能，vgd1突变体植株被用做父本或母本与野生型植株杂交。当一个纯合的vgd1植株作为母本与野生型植株杂交时，几乎所有的胚珠（455中有449个）能够产生与野生型一样有生存力的种子，这表明vgd1突变并不影响母本的育性。然而，在相互杂交中，只有在长角果上端的少数胚珠经过了受精作用且能够发育成种子。当一种杂合的vgd1植株作为父本与野生型植株杂交时，F1代的幼苗出现抗卡那霉素植株与对卡那霉素过敏植株比例为1:40.8（80:3261）的分离，而不是期望的1:1分离。此结果显示了vgd1突变引起一种配子的缺陷。总的来说，这种vgd1突变导致了雌配子的功能的缺陷，但并不影响雌性配子的的功能。

当一个杂合的vgd1植株作为母本与一个野生型植株杂交时，F1代幼苗表现出抗卡那霉素（Kanr）与对卡那霉素过敏（Kans）接近1:1（321:316）的平均分离比率。所有的Kanr F1代幼苗可以产生完全可育性植株。通过Kanr F1代自交得到的所有F2代表现出vgd1突变体的显性分离。当一个纯合的vgd1植株作为母本与一个野生型植株杂交时，所有的F1代幼苗萌芽时都是Kanr型且成熟时都具有完全可育性，所有F2代也都表现出vgd1突变体的显性分离。

vgd1突变阻碍了花柱和生殖通道中花粉管的伸长

遗传方面的研究表明：当授以vgd1花粉时，仅有几粒种子的是产生在野生型或

vgd1长角果的上端。为调查这种种子不正常着生的原因，我们用苯胺蓝染色剂和电子显微镜扫描技术来比较vgd1花粉管与野生型花粉管在花柱和生殖通道中的生长速度。如图2A所示，vgd1花粉管能够在柱头细胞中萌发和生长，这与野生型花粉管是相似的（图2B)。因此，不同的是vgd1突变体影响雌性柱头组织中花粉管萌发的能力。TEM观察显示：vgd1花粉管与野生型花粉管一样，也能在柱头细胞壁内部和花柱和生殖通道的细胞间隙中生长（图2C－2F）。此结果指出，vgd1花粉管的穿入速率与野生型相比有所降低。野生型花粉管能够在授粉4 h后穿过花柱（图3A)，并在授粉12 h到达花粉管通道的基部（图3C)。相反的，在授粉4 h，vgd1花粉管被限制在柱头组织内（图3B)，且需24 h才能穿过花柱（图3D)；在授粉48 h，它们仅仅能够到达接近花粉管通道长度的一半（图3E)。这个结果与用vgd1花粉授粉时，野生型或vgd1突变体的长角果仅产生在上部的事实是一致的。

vgd1花粉管在离体培养中是不稳定的

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