基因工程
一 名词解释
1、限制与修饰系统：限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主细胞不受外源DNA的感染，可讲解外来DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。一般来说，与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶，或者说是甲基化酶，能保护自身的DNA不被讲解。限制酶和甲基转移酶组成限制与修饰系统。 2、各种限制与修饰系统的比较
识别位点 切割位点 Ⅱ型 4~6bp，大多为回文序列 在识别位点中或靠近识别位点 Ⅰ型 二分非对称 无特异性，至少在识别位点外100bp Ⅲ型 5~7bp非对称 识别位点下游24~26bp 简答 1.何谓 Star activity？简述 Star activity 的影响因素及克服方法？
答： 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。 引起星星活性的的因素：①高甘油浓度（>5%）；②酶过量（>100U/μl）；③低离子强度（<25mmol/L）；④高 pH (>8.0)；⑤有机溶剂如 DMSO （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；⑥用其它二价阳离子 Mn2+、Cu2+、Co2+ 或 Zn2+ 代替 Mg2+ 。
星星活性的抑制措施：①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；③提高离子强度到 100～150mM （在不抑制酶活性的前提下）；④降低反应 pH 至 7.0 ；⑤使用 Mg2+ 作为二价阳离子。
2. 试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素？ （影响酶活性的因素？） 答： 外因：反应条件、底物纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当，
反应体系的选择、反应时间的长短
内因：星星活性、底物甲基化、底物的构象
3、DNA末端长度对酶切割的影响
答：限制酶切割 DNA 时，对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切割扩增的PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。一般需加 3～4 个碱基对。
4、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？
答： 将外源 DNA 或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备：①在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）；②必须具备合适的酶切位点，供外源 DNA 片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于筛选；④其它：有一定的拷贝数，便于制备。
5抗性基因（Resistant gene）是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？
答：氨苄青霉素抗性基因（ampr）、四环素抗性基因（tetr）、氯霉素抗性基因（Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（kanr , neor）以及琥珀突变抑制基因 supF 。
⑴青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。氨苄青霉素抗性Ampr 编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化 β-内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。
⑵四环素与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。 Tetr 编码一个由 399 个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。
6.何为 α-互补？如何利用 α-互补来筛选插入了外源 DNA 的重组质粒？
答：α-互补 指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的 β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。 α-互补是基于在两个不同的缺陷 β－半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。实现 α-互补主要有两部分组成： LacZ△M15 ，放在 F 质粒或染色体上，随宿主传代； LacZ' ，放在载体上，作为筛选标记，当在 LacZ' 中插入一个片断后，将不可避免地导致产生无 α-互补能力的 β－半乳糖苷酶片断。在诱导物 IPTG 和底物 X-gal（同时可作为生色剂）的作用下，含重组质粒的菌落不能产生有活性的 β－半乳糖苷酶，不能分解 X-gal ，呈现白色，而含非重组质粒的菌落则呈现兰色。以此达到筛选的目的。
7、试简述λ噬菌体的裂解生长状态Lytic growth 和溶原状态Lysogenic state 两种循环的分化及其调节过程？
答：裂解生长状态是λ噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代λ噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂解。溶原状态为λ噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主染色体 DNA 中随宿主的繁殖传到子代细胞。调节过程： 由感染复数和细胞的营养状态决定的，感染复数越高，营养状态越差，则溶源化的频率就越高。溶源现象的生化媒介可能是3'--5'cAMP，它在细胞内的浓度会随营养条件的变化而改变，当细胞在富营养培养基中生长时，cAMP 的浓度较低，有利于裂解生长；在缺乏cAMP的突变细胞中，更有利于裂解生长另外一个重要的调节因素是噬菌体的CⅡ蛋白，它是噬菌体基因转录的激活子，抑制裂解功能基因的表达，催化噬菌体 DNA 整合到细菌的染色体中去。高浓度的CⅡ蛋白促进溶源化，而低浓度的CⅡ蛋白促进裂解生长。当CⅡ蛋白浓度足够时，激活CⅠ蛋白和基因 int 的表达，导致噬菌体DNA与染色体整合，朝着溶源态生长。
9、cDNA文库的构建：将来自真核生物的mRNA体外反转录成cDNA，与载体连接并转化大肠杆菌的过程。 ⑴细胞总RNA的提取和mRNA的分离
⑵第一链合成：由mRNA到cDNA的过程为反转录，由反转录酶催化。
⑶第二链合成：①自身引物合成法 ②置换合成法 ③引导合成法 ④引物—衔接头合成法 ⑷双链cDNA里连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中繁殖
10、文库质量检测
答：文库质量是由文库所含克隆的数目、平均插入片段的长度、插入效率、基因组覆盖度和覆盖倍数等因素决定。克隆数越多、平均插入片段的长度越长、插入效率和基因组覆盖度越高，文库质量越好。克隆数目可以通过多次转化累加，但并非越多越好，只要达到一定数目的基因组覆盖倍数和覆盖度就行，一般要求达到4—6倍覆盖率。
11、基因覆盖倍数的估算方法
答：有两种，一：用公式计算 基因组覆盖倍数=平均插入片段的长度ⅹ克隆数/基因组DNA长度
二：结合基因覆盖度检测来估算。 基因组覆盖度是指问苦衷克隆覆盖基因组的范围。即选
择一定数目的单拷贝基因作探针来筛选文库。每个探针筛选的克隆数目，即为该基因位点的覆盖倍数。
12、解释并计算N=ln(1-P)/ln(1-f)
式中N：代表一个基因组文库所包含重组克隆个数 P：代表所期望的目的基因在文库中出现的概率 f：表示重组克隆平均插入片段的长度和基因组DNA长度的比值
计算：大肠杆菌基因组大小约4.6 mb，若P=99%，平均插入片段大小为20kb，f=20kb/4600kb,
则N=1057.即当期望从一个平均插入片段为20kb的大肠杆菌基因组文库中筛选到任意一个感兴趣的基因的概率达99%，该基因文库至少应包含1057个重组克隆。选择合适的载体系统和挑去一定的阳性克隆是构建基因组文库时首先考虑的问题。
论述题
1、酵母双杂交系统 （画图） P207
简称双杂交系统（two-hybricl system）也叫相互作用陷阱（interaction trap）是根据真核生物转录调控的特点，创建的一种体内鉴定基因的方法。其筛选的基因不是“探针”的直接编码产物，而是能够与其相互作用的蛋白质的编码基因，即筛选与一直基因产物发生相互作用的蛋白的编码基因。
许多真核生物转录激活因子有两个功能区域，一是DNA结合结构域（DNA binding domain,BD），可与DNA序列的特定位点即上游激活序列结合；二是转录激活结构域（activation domain,AD）,协助RNA聚合酶‖复合体激活上游激活序列下游基因的转录。将X与BD融合，蛋白Y与AD融合，将它们导入酵母细胞中表达，如果X和Y相互作用，则会导致BD和AD在空间上接近，形成一个有功能的转录激活因子，激活下游报告基因的表达。
2、Sanger双脱氧链终止法（画图） P158
双脱氧链终止测序法使用双脱氧核苷酸，它与脱氧核苷酸的主要不同在于：双脱氧核苷酸分子中脱氧核糖的3’位置的羟基（—OH）缺失。扩增时，在DNA聚合酶的作用下，其5’位置的磷酸基团与上位脱氧核苷酸的3’位置的羟基结合，但是，由于其自身3’位置的羟基缺失，致使下位的5’位置的磷酸基无法与之结合。即，双脱氧核苷酸整合到正在合成的DNA链中，该DNA的合成就到此终止。
3、载体的分类
按功能分：克隆载体：（主要用于扩增或保存DNA片段，是最简单的载体。具有强大的包装能力） 表达载体：（带有目标细胞识别的启动子） 其他载体：（整合载体、穿梭载体等）
按来源分：质粒（细菌等原核生物染色体外遗传物质） 噬菌体（原核细胞的病毒） 真核病毒（真核细胞的病毒）
人工遗传物质（噬菌粒、粘粒、细菌、酵母等）
4、基因转移常用方法及对象
自然转化：细菌等原核生物直接吸纳DNA 人工导入：物理法、化学法、生物法
物理：基因枪、超声波、显微注射、体细胞核移植、点击法 化学法：PEG诱导
生物：农杆菌介导法、花粉管通道法 对象：微生物、植物、动物
5、 Southern 杂交 原理：Southern blot：一种检测 DNA 分子的方法。将 DNA 片段从琼脂糖凝胶转移到滤膜，结合了 DNA 分
子的滤膜先与特定的预杂交液进行预杂交，然后与标记的核酸探针和滤膜混合。如果滤膜上的 DNA 分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。在经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去后，通过放射自显影或生化检测，就可判断滤膜上是否存在与探针同源的 DNA 分子及其分子量。
步骤：①目的DNA用限制内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳
②0.4mol/LnaoH碱性条件下使其变性
③再用1.5mol/L Nacl、1mol/L 的Tris (ph=7.4)条件下中和，使DNA保持单链状态 ④将凝胶上的DNA原位转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上 ⑤80 °C处理或紫外照射，将DNA固定在滤膜上
⑥将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂交液进行杂交 ⑦特定溶液和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合
⑧洗涤，将游离探针分子去除，同放射自显影或生化显影，即可判断滤膜是否存在与探针同源的DNA分子及其相对分子质量。
注意：即将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中，滤膜本身对探针的吸附。
主要用来判断某一生物样品中是否存在某一基因，以及该基因所在的限制性内切片段的大小。应用该技术的前提是必须有探针。