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重组子 广4 重组子
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表中，蓝色为错样个体；绿色与紫色为相邻引物的连锁现象。 4.5 半薄切片的电镜观察
由于半薄切片的包埋一步做得不太好，导致烘箱中的包埋片不平整，两端翘起，无法切片观察，故此步实验失败。
5. 实验讨论与分析
5.1 定位操作部分
在最初开始学习定位时，PCR体系的效果一直不好，因此PAGE电泳一直没有明显清晰的条带。后来经过多次练习，查找原因（如移液器的使用方法不正确，PCR体系添加时没有混匀等）以及调整PCR体系成分，终于在第七次时获得成功。
在最初学习做聚丙烯酰胺凝胶时，很不熟练，所以凝胶中常会出现气泡；同时点样孔中经常残留有胶体，影响点样，所以电泳条带也经常不清晰。但经过几次练习也终于能够稳定发挥，做出均匀完美的聚丙烯酰胺凝胶。
除了PCR与PAGE电泳以外，平时还经常需要配制各种溶液。在配制各种溶液的过程中，也有很多的注意事项。如配制硝酸银染液时，不能用自来水冲洗银盆，因为自来水中的离子溶度很高，加入硝酸银后会出现白色浑浊现象，影响后续实验的染色。如配制丙烯酰胺母液时，甲叉双丙烯酰胺是棉絮状的白色粉末，很容易在空气中漂浮，鉴于甲叉双丙烯酰胺对人
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体的神经毒害作用，就需要佩戴口罩等等。
另外，实验室是一个公共场所，手套的合理使用是必须要了解与掌握的，不仅为了保证实验的准确性，也为了自己以及其他实验室成员的生命安全。
最后，对于实验过程中用到的各种试剂，最初不了解其具体作用，但经过询问学长和自己上网查资料，也掌握了一些试剂的配方及用处，现总结如下：
编英文简称 全 名 号 配 方 作 用 1. 在低离子强度的溶液中CTAB可沉淀核酸和酸性多聚糖，此时，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里； 1 CTAB 十六烷基三甲基溴化铵 2. 在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但是不能沉淀核酸。因此，CTAB可用于从大量产生粘多糖的有机体（如植物以及某些革兰氏阴性菌中）制备DNA。 1. 提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏; 2. 螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性; 3. 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中; 4. 抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变; 常用的生物缓冲液 2 CTAB提取缓冲液 CTAB缓冲液提取DNA配方 1. Tris-HCl(pH 8.0) 2. EDTA 3. NaCl 4. β-巯基乙醇 5. CTAB 3 Tris 氨基丁三醇 4 5 6 TE TBE TAE Tris盐酸缓冲液 Tris硼酸缓冲液 Tris醋酸缓冲液 Tris-HCl + EDTA Tris-Borate + EDTA Tris-Acetate + EDTA 常用于DNA的稳定与贮存 核酸电泳缓冲液（TBE比TAE有着更好的缓冲能力） 核酸电泳缓冲液（电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模 18
糊和不规则的DNA带迁移的现象） 7 PAGE 丙烯酰胺凝胶 化学聚合法： 以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构 用于分离蛋白质和寡糖核苷酸 8 琼脂糖凝胶 琼脂糖凝胶可以区分相差约100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但制备容易，分离范围广。普通的琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段 5.2 定位结果分析
本次定位耗时比较长，因为有些分子标记无多态性导致标记间隔太长，使某些染色体区段处于真空状态不易分析。而重新设计分子标记，结果又常常差强人意，经常无多态性或与模板匹配性不好导致DNA条带缺失或不清晰，因此无论是初定位还是精细定位，都遇到了一些困难。虽然如此，对TF13群体进行的研究仍得到了一些结论：
1. 由于Os801与Os804的重组子无相互包含关系，因此可确定突变基因位于两者
之间（Os803引物不好用，无DNA条带），并且Os804的重组子远远多于Os801的重组子，亦即Os804的连锁频率较高，因此突变基因离Os801比较近；
2. 精细定位时用Os802、HY804、新设计的有多态性的TF13-2三个引物进行研究
时，出现了连锁交叉现象，可能原因有：（a）在最初取样时出现错误，将两个群体混淆，因为从结果来看，群体中错样个体的比例相对比较高；（b）出现双交叉现象，但此种可能性较小，因为双交叉的频率很低，而实验结果中的双交叉比例则比较高；（c）因为本次实验结果为一次结果，未进行重复验证，因此可能实验结果有误差，可对剩余个体进行分析之后再确定一下结果。
3. TF13现在的群体只有284个，数目比较少，得出的结果可能不够准确。需要再
获得更多的群体进行研究。
同时，本次实习只有三周，时间较短，使得研究不够充分深入，实验也不可能在这么短的时间内结束，因此还需投入后续精力继续研究。 5.3 半薄切片分析
半薄切片的制备中可能是试剂配方出现问题（可能性不大），也可能是操作不熟练不严谨（可能性较大），使得切片制备的不成功。同时由于切片制备周期较长，材料也比较宝贵，因此尚未做第二次。
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6. 实验心得
本次实习是在张大兵老师的实验室进行的。张大兵老师对学生的要求很严格，虽然他并没有直接辅导我做实验，但我还是从实验室的师兄师姐身上学到了很多知识，受到了很大的鼓舞与启示。
通过本次实习，我对科学研究的过程有了大致的了解，明白科研其实并不是一件简单的事情，它需要持续的耐力和坚定不移的信心，需要投入很大的精力与心思。如果没有真正的兴趣与坚持探索的欲望，科研道路就意味着煎熬。但反向来说，解决科研中遇到的各种困难却又给人极大的振奋与鼓舞，让人享受其中的乐趣。
科研最需要的应该是细心，比如在本次实习中，从最初的取材到后续的每一步实验都会对实验结果产生不同程度的影响，取材中出现了错样或者将多种群体混淆在一起，都会使后续工作无法进行。而实验中的每一步操作从最初学习到熟练掌握也是一个需要细心与耐心的过程。
另外，通过本次实习，我也意识到课本学习与实验之间的联系。通过独立的进行实验，不仅对以前学过的知识有了更加直观深刻的理解，也锻炼自己的动手能力以及使用各种仪器的能力，也增强了自己吸收各种信息知识的能力。
最后，我不得不说，本次实习对我以后选择人生道路也起到了一定的推动作用。
7. 参考文献
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