12.焦磷酸酶可以催化焦磷酸水解或磷酸，其相对分子质量为120×103，由6个相同亚基组成。纯酶的Vmax为2800U/mg酶。它的一个活力单位规定为：在标准测定条件下，37℃、15min内水解10μmol焦磷酸所需要的酶量。问：（1）酶mg酶在每秒钟内水解多少mol 底物？[3.11×10-5mol]。（2）每mg酶中有多少mol的活性部位（假设每个亚基上有一个活性部位）？[5×10-8mol活性中心]。（3）酶的转换数是多少？[622s-1或622mol焦磷酸/（s?mol）酶活性中心] 解：（1）2800×10/15×1/（60×106）×1=3.11×10-5 mol （2）1×10-3/120×103×6=5×10-8 mol （3）3.11×10-5÷1×10-3/120×103×1/6=622

13.称取25mg蛋白酶粉配制成25ml酶溶液，从中取出0.1ml酶液，以酪蛋白为底物，用Folin-酚比色法测定酶活力，得知每小时产生1500μg酪氨酸。另取2ml酶液，用凯氏定氮法测得蛋白质为0.2mg，若以每分钟产生1μg 酪氨酸的酶量为1个活力单位计算，根据以上数据，求出：（1）1ml酶液中所含蛋白质量及活力单位。[0.625mg蛋白质，250U]（2）比活力。[400U/mg蛋白质]（3）1g酶制剂的总蛋白含量及总活力。[0.625g，2.5×105U] 解：（1）0.2×6.25÷（2×25/25）=0.625mg 1500/60÷（0.1×25/25）=250U （2）250÷0.625=400U/mg （3）0.625÷（1×25/25）×1×103= 0.625×103mg=0.625g 1500/60÷（0.1×25/25）÷（1×25/25）×103=2.5×105U

14.有1g淀粉酶酶制剂，用水溶解成1000ml，从中取出1ml测定淀粉酶活力，测知每5min分解0.25g淀粉。计算每g酶制剂所含淀粉酶活力单位数？[3000U]（淀粉酶活力单位定义：在最适条件下每小时分解1g淀粉的酶量称为1个活力单位） 解：0.25/5×60÷（1/1000×1）=3000U

15.某酶的初提取液经过一次纯化后，竟测定得到下列数据：试计算比活力、百分产量及纯化倍数。[比活力：180U/mg蛋白质，百分产量：17%，纯化倍数：9倍] 体积/ml 活力单位/（U/ml） 蛋白质/（mg/ml） 初提取液

（NH4）2SO4盐析 120 5 200 810 10 4 解：（1）810/4.5=180U/mg （2）810×5÷（200×120）×100%=17% （3）180÷（200/10）=9

第九章 酶促反应动力学 提要

酶促反应动力学是研究酶促反应的速率以及影响此速率各种因素的科学。它是以化学动力学为基础讨论底物浓度、抑制剂、pH、温度及激活剂等因素对酶反应速率的影响。化学动力学中在研究化学反应速率与反应无浓度的关系时，常分为一级反应、二级反应及零级反应。研究证明，酶催化过正的第一步是生成酶-底物中间产物，Michaelis-Menten该呢举中间产物学说的理论推导出酶反应动力学方程式，即Km、Vmax、kcat、kcat/Km。Km是酶的一个特征常数，以浓度为单位，Km有多种用途，通过直线作图法可以得到Km及Vmax。Kcat称为催化常数，又叫做转换数（TN值），它的单位为s-1，kcat值越大，表示酶的催化速率越高。kcat/Km常用来比较酶催化效率的参数。酶促反应除了单底物反应外，最常见的为双底物反应，按其动力学机制分为序列反应和乒乓反应，用动力学直线作图法可以区分。 酶促反应速率常受抑制剂影响，根据抑制剂与酶的作用方式及抑制作用是否可逆，将抑制作用分为可逆抑制作用及不可逆抑制作用。根据可逆抑制剂与底物的关系分为竞争性抑制、非竞争性抑制及反竞争性抑制3类，可以分别推导出抑制作用的动力学方程。竞争性抑制可以通过增加底物浓度而解除，其动力学常数Kˊm变大，Vmax不变；非竞争性抑制Km不变，Vˊmax变小；反竞争性抑制Kˊm及Vˊmax均变小。通过动力学作图可以区分这3种类型的可逆抑制作用。可逆抑制剂中最重要的是竞争性抑制，过度态底物类似物为强有力的竞争性抑制剂。不可逆抑制剂中，最有意义的为专一性Ks型及kcat型不可逆抑制剂。研究酶的抑制作用是研究酶的结构与功能、酶的催化机制、阐明代谢途径以及设计新药物的重要手段。

温度、pH及激活剂都会对酶促反应速率产生重要影响，酶反应有最适温度及最适pH，要选择合适的激活剂。在研究酶促反应速率及测定酶的活力时，都应选择酶的最适反应条件。 习题

1.当一酶促反应进行的速率为Vmax的80%时，在Km和[S]之间有何关系？[Km=0.25[S]] 解：根据米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S])得：

0.8Vmax=Vmax[S]/(Km+[S]) Km=0.25[S]

2.过氧化氢酶的Km值为2.5×10-2 mol/L，当底物过氧化氢浓度为100mol/L时，求在此浓度下，过氧化氢酶被底物所饱和的百分数。[80%] 解：fES=[S]/（Km+[S]）=100×10-3/(2.5×10-2+100×10-3)=80%

3.由酶反应S→P测得如下数据： [S]/molL-1 V/nmolL-1min-1 6.25×10-6 15.0 7.50×10-5 56.25 1.00×10-4 60.0 1.00×10-3 74.9 1.00×10-2 75.0

（1） 计算Km及Vmax。[Km：2.5×10-5，Vmax：75 nmolL-1min-1] （2） 当[S]= 5×10-5 mol/L时，酶催化反应的速率是多少？[50.0 nmolL-1min-1] （3） 若[S]= 5×10-5 mol/L时，酶的浓度增加一倍，此时V是多少？[100 nmolL-1min-1] （4） 表中的V是根据保温10min产物生成量计算出来的，证明V是真正的初速率。 解：（1）由米氏方程得：

15=Vmax?6.25×10-6/ (Km+6.25×10-6)……① 60=Vmax?10-4/（Km+10-4）……② 由①、②得：Km=2.5×10-5，Vmax=75 nmolL-1min-1 （2）V=75×5×10-5/（2.5×10-5+5×10-5）=50.0 nmolL-1min-1 （3）50×2=100 nmolL-1min-1 （4）带如米氏方程可验证。

5.某酶的Km为4.7×10-5 molL-1，Vmax为22μmolL-1 min-1，底物浓度为2×10-4 molL-1。试计算：（1）竞争性抑制剂，（2）非竞争性抑制剂，（3）反竞争性抑制剂的浓度均为5×10-4 molL-1时的酶催化反映速率？这3中情况的Ki值都是3×10-4 molL-1，（4）上述3种情况下，抑制百分数是多少？[（1）13.54μmolL-1 min-1，24%；（2）6.68μmolL-1 min-1，62.5%；（3）7.57μmolL-1 min-1，57.5%] 解：（1）竞争性抑制剂的米氏方程为：V=Vmax[S]/(Km(1+[I]/Ki)+[S]) 代入数据得：V=13.54μmolL-1 min-1 i%=（1-a）×100%=（1-Vi/Vo）×100%=24%

（2）非竞争性抑制剂的米氏方程为：V=Vmax[S]/((Km+[S])(1+[I]/Ki)) 代入数据得：V=6.68μmolL-1 min-1 i%=（1-a）×100%=（1-Vi/Vo）×100%=62.5%

（3）反竞争性抑制剂的米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S](1+[I]/Ki)) 代入数据得：V=7.57μmolL-1 min-1 i%=（1-a）×100%=（1-Vi/Vo）×100%=57.5%

6．今制得酶浓度相同、底物浓度不同的几个反应混合液，并测得反应初速率，数据见下表。请利用“Eadie-Hofstee”方程式，用图解法求出Km值及Vmax值。这种作图法与Lineweaver-Burk作图法比较有何优点？[Vmax=160μmolL-1 min-1,Km=8.0×10-5 molL-1] [S]/molL-1 V/μmolL-1min-1

4.0×10-4 130 2.0×10-4 110 1.0×10-4 89 5.0×10-5 62 4.0×10-5 53 2.5×10-5 38 2.0×10-5 32

解：将米氏方程改写成：V=Vmax-Km?V/[S],以V-V/[S]作图，得一直线，其纵截距为Vmax，斜率为-Km，由图得Vmax=160μmolL-1min-1,Km=8.0×10-5 molL-1 优点：实验点相对集中于直线上，Km和Vmax测定值较准确。

7.对一个遵从米氏方程的酶来说，当底物浓度[S]=Km，竞争抑制剂浓度[I]=Ki时，反应的初速率是多少？[V=1/3Vmax]

解：根据米氏方程可得：V=Vmax[S]/ (Km(1+[I]/Ki)+[S]),其中[S]=Km，[I]=Ki V= VmaxKm/ (Km(1+Ki/Ki)+Km)=1/3 Vmax

8.用下列表中数据确定此酶促反应：（1）无抑制剂和有抑制剂的Vmax和Km值。[无抑制剂时Km=1.1×10-5 molL-1，Vmax=50μmolL-1min-1，有抑制剂时：Km=3.1×10-5 molL-1，Vmax=50μmolL-1min-1]（2）EI复合物的解理常数Ki。[Ki= 1.10×10-3molL-1]

[S]/molL-1 V/μmolL-1min-1 无抑制剂 有抑制剂（2.0×10-3 molL-1） 0.3×10-5 10.4 14.5 22.5 33.8

40.5 4.1 6.4 11.5 22.6 33.8 0.5×10-5 1.0×10-5 3.0×10-5 9.0×10-5 解：（1）无抑制剂时：V=Vmax[S]/(Km+[S])，将表中数据代入此式可得Km=1.1×10-5 molL-1，Vmax=45.1μmolL-1min-1

对表中数据用V对[S]作图，求Km值，可判断有抑制剂时，Km值明显增大，故该抑制剂应为竞争性抑制剂。据V=Vmax[S]/(Km(1+[I]/Ki)+[S])以及Vmax不变的性质可得，此时Vmax=45.1μmolL-1min-1，Km=3.1×10-5 molL-1，Ki= 1.10×10-3molL-1

9．同上。