应提供主要原材料如引物、探针、企业参考品或标准品等的选择与来源、制备过程、质量分析和质控标准等的相关研究资料。若主要原材料为企业自己生产，其生产工艺必须相对稳定；如主要原材料来自市场（从其他单位购买），应提供的资料包括：对物料供应商审核的相关资料、购买合同、供货方提供的质量标准、出厂检定报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。

1.企业内部参考品的制备、定值过程。建议采用灭活病毒建立参考品，不宜使用质粒。

2．核酸分离/纯化组分（如有）的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。

3．PCR组分的主要材料（包括引物、探针、内标、各种酶及其它主要原料）的选择、制备、质量标准及实验研究资料，主要包括以下内容：

（1） 脱氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的组成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，对纯度、浓度、保存稳定性等的详细验证资料。

（2）引物

由一定数量的dNTP构成的特定序列，通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。对序列准确性、纯度、稳定性、功能性实验等的验证。如为外购，应提供合成机构出具的合成产物的质检证

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明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱。

（3） 探针

特定的带有示踪物（标记物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能与互补核酸序列退火杂交，用于特定核酸序列的探测。合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化，在5'-端(和/或3'-端)进行标记，如荧光素报告基团或其他发光标记物，在3'-端标记荧光素淬灭基团，并经HPLC或其他适宜方法纯化。纯度应达到HPLC纯，应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如HPLC分析图谱；应对探针的核酸序列及标记的荧光素或化学发光物进行核实，并作HPLC分析。

（4） PCR反应所需酶

DNA聚合酶，应具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性，具热稳定性，如：94℃保温1小时后仍保持50%活性；尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性，应对酶活性有合理验证；应提供有关保存稳定性、活性及功能实验等的验证资料。

4．内对照（内标）、定标品、对照品（质控品）的原料选择、制备、定值过程及试验资料。内标可采用灭活的病毒或缺陷病毒（假病毒）、质粒。定标品及外部阳性对照宜采用灭活病毒或假病毒。

5．核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无DNase和

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RNase污染。

（六）主要生产工艺及反应体系的研究资料

基本生产工艺主要包括：配制工作液、半成品检定、分装和包装。配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求，原材料应混合均匀，配制过程应对pH、电导率等关键参数进行有效控制。

生产工艺研究的资料应能对反应体系涉及到的基本内容，如样本类型、样本用量、试剂用量、反应条件、校准方法、质控方法、稳定性和有效期，提供确切的依据，主要包括以下内容：

1.主要生产工艺介绍，可以图表方式表示。 2.反应原理介绍。

3.基因位点选择、PCR方法学特性介绍。

4.DNA提取纯化方法优化，建议包含纯化步骤，内标、标准品、质控品均应全程参与提取纯化。不建议采用煮沸法进行DNA提取。

5.确定最佳PCR反应体系的研究资料，包括酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度、样本量、加样量及反应体积等。样本量应不少于200微升、加样量应不少于20微升、反应体积应不少于40微升。

6.确定最适PCR反应各阶段温度、时间及循环数的研究资料。

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7．对于基线阈值（threshold）和阈值循环数（Ct）确定的研究资料。

8.不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述。 另外，对于试剂盒的内标、定标品、对照（质控）品设置，建议企业参考以下要求执行：

（1）乙肝病毒核酸定量检测试剂盒的外部对照（质控）品应至少设置三个量级水平的系列定标品:临界阳性对照（质控）品、强阳性对照（质控）品和阴性对照（质控）品，定标品和质控品均应参与样本核酸的平行提取，以对整个PCR反应过程、试剂/设备、交叉污染等环节进行合理质量控制。企业应对各种对照（质控）品的Ct值做出明确的范围要求。注意，建议采用与实际检测样本具有相同或相似性状的基质溶液作为阴性对照（质控）品，不推荐采用水作为阴性对照（质控）品。

（2）样本反应管应设置合理的内对照（内标）以对管内抑制可能造成的假阴性结果进行质控。申请人应对内标的引物、探针和模板的浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线但又不能对目的基因的检测造成竞争性抑制而导致假阴性。对内标的Ct值也应有明确的范围要求。

（七）分析性能评估资料

企业应提交原厂在产品研制或成品验证阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，对于每项分析性能的评价都

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