《酶组织化学与免疫组织化学技术》习题

第一部分组织学技术和免疫组织化学技术

一、选择题

（一）A1型题(标准型) 1.C 2.B 3.A 4.C 5.A 8.B 9.C 10.D 14.A 23.D 1.免疫组化技术的关键步骤是 A.标本处理

B.抗体的处理与保存 C.免疫染色

D.设立对照试验 E.结果判断

2.免疫组化技术的首要试剂是 A.抗原 B.抗体 C.标记物 D.固定剂 E.洗涤液

3.酶免疫组化技术中，关于标本处理的说法正确的是

A.充分洗后于室温用0.3%H2O2和80%甲醇处理20～30min。 B.充分洗后于室温用0.3%H2O2和80%甲醇处理40～50min。 C.充分洗后于室温用0.5%H2O2和90%甲醇处理20～30min。 D.充分洗后于4℃用0.3%H2O2和80%甲醇处理20～30min。 E.充分洗后于4℃用0.3%H2O2和80%甲醇处理40～50min。 4.PAP法是Sterberger等于哪一年建立的 A.1950 B.1960 C.1970 D.1980 E.1990

5.PAP复合物中的酶是 A.辣根过氧化物酶 B.碱性磷酸酶 C.葡萄糖氧化酶 D.胃蛋白酶 E.胶原酶

8.PAP法中的“桥”是 A.第一抗体 B. 第二抗体 C. 第三抗体 D.亲和素 E.第四抗体

9.ABC技术由美籍华人Hsu于哪一年建立，已广泛应用于免疫学检测技术 A.1961

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B.1975 C.1981 D.1985 E.1990

10.ABC法中的“桥”是指 A.第一抗体 B. 第二抗体 C. 第三抗体 D.亲和素

E.链霉素亲和素

14.免疫组化法吸收试验是用过量已知抗原与抗体在多少度以下充分反应，离心后再行免疫组化染色 A.4℃ B.20℃ C.40℃ D.37℃ E.50℃

23．PAS反应是检测组织内的： A.核酸 B.脂 C.蛋白质 D.多糖 E.抗原

一、填空

1、免疫组织化学中最常用的标记物是__荧光素________、___酶_________ 、____生物素和亲和素_______、___________。原位杂交组织化学中常用的标记物有___________和___________两大类。

2、 常用的粘附剂有__________、____________ 、__________等。

3、抗原决定簇是指_____________分子表面的、具有活性的___________。

4、一般组织化学是利用化学或物理反应，在组织标本上加入一定的_____________，使其发生反应，形成_____________，能在显微镜下观察。常用于检测__________、____________ 、__________等。

5、酶组织化学是利用酶对其____________的催化作用 ，生成__________，再与某种__________反应，形成____________沉淀，检测___________分布及活性的方法。常用的方法有___________ 、___________、____________、__________和____________。 6、最常用于显示细胞、组织内的多糖和蛋白多糖的方法是 过碘酸-雪夫反应PAS。

7.、免疫染色对特殊标本的进一步处理常用 ________和________法。 8、免疫组化中最常用的制片方法是________和________。

9、免疫组化染色后，阳性细胞的染色分布有三种类型，分别是_________、_________和_______。

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10、酶免疫组化技术中最常用的酶有_________、__________及_________。 11、免疫电镜标本的制备主要有_________、__________和_________三种。 12、组织块包埋前需先经______，常用的包埋剂是______、______和______。

13、光学显微镜下观察的固定标本除组织切片外，还有______、______和______。 14、免疫细胞化学术中常用的标记物有______、______、______和______。

填空 1、荧光素、酶、生物素和亲和素、铁蛋白和胶体金。放射性同位素、非同位素标记物（非放射性同位素）。2、蛋白甘油、甲醛明胶、多聚赖氨酸。3、抗原、特异性化学集团。4、化学试剂，有色沉淀物，糖类、脂类、核酸、酶。5、底物，初反应产物，捕捉剂，有色终反应物沉淀，酶。金属沉淀法、偶氮偶联法、四唑盐法、靛蓝法、DAB法（联苯胺法）。6、PAS反应（过碘酸希夫反应）。 7、蛋白酶消化法，非特异吸附法8、冰冻切片，石蜡切片 9、胞质型 细胞核型，细胞膜表面型

10辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶 葡萄糖氧化酶

11、非包埋法免疫染色，包埋前免疫染色，包埋后免疫染色 12、固定，石蜡，火棉胶，树脂 13、涂片，铺片，磨片

14、荧光素，酶，铁蛋白，胶体金 二、名词解释

1.HE染色法

2、固定：在保持组织形态完好和被检测抗原的前提下，应采用浓度最低的固定剂和最短的固定时间，固定时间一般为1-12小时，常用的的固定液有醛类固定剂、丙酮及醇类固定剂以及其他固定剂。

2.银染法 3.冷冻切片

4.组织化学和细胞化学术 5.免疫细胞化学术 6.原位杂交 7.胶体金

8.简述石蜡切片的制备过程。 9、背景着色

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10、一抗和二抗 11、探针

12、免疫组织化学技术

1、HE染色法是一种最基本的组织切片染色方法，广泛应用于教学和科研中。染色液是由苏木精（hematoxylin，碱性染料）和伊红（eosin，酸性染料）配制而成，苏木精使细胞核和细胞质内的嗜碱性物质着紫蓝色，伊红使细胞质基质和间质内的胶原纤维等着红色，染色鲜艳，观察方便。 2、银染法是用硝酸银配制的溶液浸染组织切片或细胞的染色方法。有些结构可直接使硝酸银还原，银粒附着在结构上而显色，称此为亲银性；有些结构无直接还原作用，需加入还原剂才能使银粒附着在结构上，称此为嗜银性。有些结构和细胞可以这种银染法而显示，如网状纤维（又称嗜银纤维），神经细胞内的神经原纤维、神经胶质细胞内的某些成分，以及一些神经内分泌细胞内的分泌颗粒等。用银染法显示的细胞，有的可称为嗜银细胞。

3.冷冻切片是新鲜组织或固定组织在低温下快速冷冻后制备组织切片的方法。一般是将组织块置入干冰或液氮内使其快速冻结，然后在恒冷箱切片机内制冷冻切片。这种方法制片快速，常用于外科手术切除标本的快速病理诊断。由于这种制片方法可免去组织块包埋等程序，细胞和组织内的一些成分如糖原、酶等保存较好，故较适用于组织化学和细胞化学染色研究。4.组织化学和细胞化学术是应用化学或物理反应原理显示组织切片或细胞内某种化学成分，进行定位、定量及其与功能相关研究的方法。方法种类甚多，显色反应的原理也各不相同，分别用于显示组织或细胞内的多糖类、脂类、各种酶及核酸等成分。一些经典的染色方法如PAS反应显示组织内的多糖和蛋白多糖等，Feulgen反应显示细胞核内的DNA，用Sudan等染料显示脂肪细胞，以及显示细胞内酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、ATP酶、琥珀酸脱氢酶、过氧化物酶等的方法。

5.免疫细胞化学术是应用免疫学原理，通过特异性标记抗体与抗原（某种蛋白质、多肽等）的结合来显示细胞内某种抗原，并进行定位和定量的研究方法。这种方法特异性强，敏感性高，进展迅速，应用广泛，已成为当今生命科学诸多学科及临床医学检验普遍应用的重要手段。机体组织内的蛋白质种类繁多，多种蛋白质和多肽已被提纯并制成其抗体，目前有多种标记二抗（酶标记、荧光素标记、胶体金标记等）商品供应，使免疫细胞化学的操作更简便，应用更普遍。6.原位杂交术是在免疫细胞化学的基础上发展起来的一种核酸分子杂交技术，用来检测细胞内某种蛋白质的基因（DNA片段或mRNA片段）表达和定位与定量研究，目前已成为细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。其基本原理是应用已知的并被标记的核酸片段（同位素或荧光素、酶等标记的探针）与细胞内待测核酸（RNA或DNA片段）进行杂交，在光镜和电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位。 7.胶体金.胶体金是氯金酸在还原剂如白磷、维生素C枸橼酸纳和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。

8.石蜡切片制备程序：①取材与固定；②脱水、透明与包埋；③切片与染色；④封固。

1、背景着色 2、一抗和二抗 3、探针 4、免疫组织化学技术 答案： 名词解释：1、是指免疫组化过程中产生的非检测抗原（或抗体）的着色，又称非特异性着色，往往造成假阳性。可干扰显色结果的判断，因此染色时，应尽量减小或消除背景着色。 2、第一抗体，简称一抗（Ab1）：是针对待测抗原的抗体。第二抗体，简称二抗(Ab2)：是用一抗作为抗原免疫另一种动物制备的抗体3、探针是指已知碱基序列的、用标记物标记了的一段核苷酸片断，用来检测组织或细胞内的某一特定DNA片段或RNA片段。

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4、是应用抗原、抗体间特异性免疫反应的原理,用标记物标记的已知抗体（或抗原）检测组织细胞内的蛋白质、多肽等相应的抗原（或抗体）的方法。 三、简答题

1.免疫组织化学的全过程包括哪些步骤？

答： 1）抗原的提取与纯化 2）免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体及纯化 3）标记物与抗体结合形成标记抗体 4）标本的处理 5）抗原抗体反应和呈色反应 6）显微镜下观察结果

2.免疫组化标本固定时，好的固定剂应满足哪些要求？

答：1）能快速固定抗原 2）防止抗原物质扩散3）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应。

3.简述荧光免疫组化技术直接法的原理。

答：将荧光素标记的已知抗体（或抗原）与切片（印片）中相应抗原（或抗体）直接发生反应，以检测组织与细胞标本中的靶抗原（或抗体）。 4.何谓免疫电镜技术？

答：免疫电镜技术是将抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合的在亚细胞和超微结构水平上对抗原进行定位分析的一种高度精确、灵敏的技术。 四、论述题

1.试述酶免疫组化技术的原理及其应用。 2. 试述任意3种酶组织化学技术的反应原理。

3. 试述免疫荧光双标记技术（间接法）的原理和当两种一抗及两种二抗分别混合使用时应注意的问题。

4. 试述免疫组织化学ABC技术中，组织抗原、一抗、二抗和ABC如何依次相互结合的。

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1、酶免疫组化技术的原理：

酶免疫组化技术是利用酶标记已知抗体（或抗原），然后与组织标本中相应抗原（或抗、1体）在一定条件下相互结合形成带酶分子的复合物，酶遇到底物时，能催化底物水解，或氧化或还原，产生有色的不溶性产物，出现显色反应，在显微镜下进行细胞与组织表面或内部某种抗原成分的定位观察分析。 酶免疫组化技术的特点：敏感性较免疫荧光技术更高，可用普通光学显微镜和电子显微镜观察结果，便于对组织细胞微细结构的分辩，染色标本可长期保存。 应用：⑴恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断； ⑵确定转移性恶性肿瘤的原发部位； ⑶对某类肿瘤进行进一步的病理分型；

⑷软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的组织学分类，因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的； ⑸发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范围的确定。 ⑹为临床提供治疗方案的选择。

2、酸性磷酸酶反应原理：铅法和重氮偶联法

1.铅法：在PH为5.0的条件下，酸性磷酸酶（ACP）水解其底物：β-甘油酸钠，产生PO43-,后者被捕获剂Pb(NO3)2的Pb2+直接捕获形成无色的Pb3 (PO4)2沉淀，后者又与(NH4)2S发生置换反应，最终形成棕黑色沉淀。 2.重氮偶联法：α-苯酚磷酸钠或萘酚AS-BI磷酸被酶水解放出萘酚，后者立即被重氮盐捕获偶联而生成有色偶氮色素沉淀（红色）。 乙酰胆碱酯酶反应原理：

亚铁氰化铜法：乙酰胆碱酯酶（AChE）能将乙酰胆碱盐水解产生硫胆碱，使铁氰化物还原为亚铁氰化物，后者与铜离子结合成亚铁氰化铜而呈现有色沉淀(棕色)。 NO合酶反应原理：

NADPH-d法：一氧化氮合酶可催化前体物质L-精氨酸转变成为L-瓜氨酸和NO，由于NOS和NADPH-d可能为同一种酶，并且都可以还原辅酶Ⅱ（NADPH）为辅助因子，介导NOS催化L-精氨酸转变成为L-瓜氨酸和NO，并释放电子，后者又被NADPH传递给硝基四唑兰（N-BT）, N-BT可被还原为有色沉淀（蓝色）。

3、基本原理：将两种抗体分别用不同的荧光色素加以标记，用来定位同一细胞内存在两种不同成分，以便根据两种成分的定位试图说明该细胞的生物功能。

注意的问题：抗两种一抗同时加入，二抗甲先加入，二抗乙后加入。1、整个程序

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均在室温下，湿盒内进行。 2、一抗和二抗均用PBS稀释，一抗的浓度要比PAP法中高得多，越位后者的5倍 。3、甘油封片后须立即镜检或置于4℃冰箱中待检 。4、实验中若想两步完成四步实验程序，应注意：a.抗甲抗原抗体和抗乙抗原抗体非同种抗体（如鼠抗和兔抗），且不能相互竞争受体。b.两种二抗必须与一抗相对应（如鼠抗对应兔抗）。

4、ABC法是在LAB法和BAB法的基础上发展起来的，此法需要两种抗体，即第一抗体和第二抗体参与反应，其中第二抗体分子上结合有生物素而称为生物素化第二抗体。同时，按一定比例将亲和素与过氧化物酶标生物素结合在一起，形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC复合物），即一个亲和素分子上的4个生物素结合位点中的3个被结合上了过氧化物酶标记的生物素分子，还剩一个位点未被结合，该位点将用来结合生物素化第二抗体。

染色的基本步骤：先是是第一抗体与标中的相应抗原结合，再使用生物素化第二抗体与第一抗体结合，然后使ABC复合物与生物素化第二抗体结合，最后通过过氧化物酶的酶组织化学染色反应显示组织或细胞中相应成分。

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