5 注意事项

(1) (2) (3) (4) (5) (6)

琼脂糖溶液微波加热时间不易过长，以免液体大量蒸发； 所用器具需要高压灭菌；

碱裂解过程中混和的动作要温和，切勿振荡。

将融好的凝胶倒入制胶床前需要冷却至70②以下，高温凝胶会使制胶床变形； 凝胶放入电泳槽时点样孔靠近阴极侧（通电后气泡较多的一侧）； 上盖的小凸块应插入槽体，并压下安全按钮；

(7) 本实验中使用的染色剂的是GoldView，无毒。但实验中依然应注意戴手套操作，

且接触染料的手不要随意接触其他器皿，养成良好的实验习惯。

6 实验结果

（1）菌液OD值

提取菌液在稀释四倍后（1ml菌液，3ml水）的吸光度为：pUC：0.443， pET：0.824。 （2）在可见光区测定提取的质粒吸光度

两份样品得到结果分别为：

9 / 13

结果整理如下：

表1 提取质粒各项指标

pET pUC 21.5 28.7 0.343 0.361 0.429 0.573 0.225 0.300 1.91 1.91 1.25 1.59 （3）电泳

琼脂凝胶中琼脂糖的浓度为1.0% 电泳得到的图片为：

从左至右依次为同组实验者的跑胶结果，较暗区域内的是我做的结果，左边两条可能浓度较低而显得稍暗，但各个条带均是清晰可见的。

根据DNA Marker可以读出四条胶带的bp值：

10 / 13

表2 电泳结果

样品 bp值 参考值 pET（酶切） 5200 5369 pET 3300 / pUC（酶切） 2300 2686 pUC 1800 / 从电泳结果可以看出，这次质粒提取比较成功，得到了较为理想的质粒并成功的进行了酶切，从电泳结果来看效果很好。但提取出的两份质粒的浓度均不是很高，可能是由于实验过程中某些操作不理想导致了一些损失。

酶切后的线性片段与环状质粒相比，明显可以看出环状质粒的表观分子量更小，但实际上二者是相同的，之所以电泳结果不同，是由于环状质粒在凝胶电泳中由于自身环化使其在凝胶中的阻力变小，在凝胶中运动的更快，所以表现出更“轻”的现象。

同时与同组的其他实验者相比较，与我同组的另一实验者（从左至右第二组）的实验结果与我的结果非常相近，但却与另外两组的结果却相差较大。分析实验过程，结果相近的两组均为同步进行的操作，添加的试剂与时间均完全相同，所以这可能是导致实验差异的原因。

7 思考题

（1）溶液I、II和III中各成分在裂解过程中的作用是什么？

所谓溶液I、II和III指的就是：Buffer A1、Buffer B1、Buffer N1

11 / 13

Buffer A1 中含有：葡萄糖、EDTA、Tris-Cl、RNase A。葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒DNA；EDTA的作用是络合掉Mg2+等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用；Tris-Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适pH范围；RNase A的作用是降解RNA。

Buffer B1中含有：SDS、NaOH。SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性；NaOH(pH>12)的作用是破坏氢键，使DNA分子变性。

Buffer N1：KAc、HAc。可以中和Buffer B1的碱性,使DNA复性，而由于染色体DNA与质粒DNA的性质的不同，将导致两种DNA的分离，即染色体DNA相互缠绕，而

+

质粒DNA复性成环；K会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离，此外，高盐溶液也有利于各种沉淀的形成,但需在后续的步骤中出去盐。

（2）沉淀法浓缩核酸可以采用的有机溶剂有哪些？试分析各种溶剂沉淀法的优缺点。

溶剂沉淀法是指某些有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，使溶解度的降低，同时，由于有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中可以分离出去。常使用的有机溶剂多为乙醇、丙酮、异丙醇和甲醇等。

各种溶剂沉淀法比较：

1、金属离子沉淀法要求纯度高，且耗电量大；

2、等电点法 转置复杂，要求纯度也较高； 3、盐析法的电解装置不易清洗；

4、有机溶剂沉淀法成本较低，但可能有较大毒性。 （3）所提取的质粒样品中可能含有哪些杂质，如何去除？

所提取的质粒样品中可能混有蛋白质、RNA、相关盐离子等。

对于蛋白质：酚-氯仿抽提：酚和氯仿可以使蛋白质变性，离心后变性蛋白质存在于有机相和水相之间的界面，吸取上层含有DNA与水相，继续用氯仿抽提可以进一步使残留的蛋白质变性并去除水相中残留的酚。由此得到纯度较高的DNA水溶液，可以加盐和乙醇最后经高速离心得到DNA沉淀。

对于RNA：可重新加入一定量RNase A酶，切断RNA，并再次重复进行离心过滤等操作，可除去RNA。

盐离子：清洗、离心。

（4）质粒样品中含有的各种杂质在琼脂糖中的泳动速度次序？

在制得的质粒样品中，可能会混有寡糖苷酸、RNA、染色体DNA等杂质。

泳动速度由大到小为：寡糖核苷酸>RNA>染色体DNA。 （5）超螺旋、开环和线性质粒的电泳速度次序，凝胶浓度对其影响？

电泳时，影响不同分子在凝胶中的移动速率不同的主要因素在于各种不同分子的结构与分子量的不同。物质分子的体积越大，或者分子量越大，其所受阻力越大，迁移的越慢。

当分子量相同的时候，迁移速度为：超螺旋质粒>开环质粒>线性质粒。

凝胶浓度越大，对DNA分子的粘滞力越大，DNA移动速率越慢。

（6）除琼脂糖凝胶电泳之外，质粒的分析鉴定方法还有哪些？试分析各种分析方法的优缺点。

抗生素筛选：抗生素筛选操作简单，但工作量大，并可能出现假阳性；

12 / 13