质粒DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳 下载本文

碱基之间的平面基团,DNA与之结合后在紫外线照射下呈现荧光。

实验室中最常用的荧光染料是溴化乙锭(EB)。其原理是在紫外线照射时,核酸的吸收波长为254nm的紫外线并将能量传递给溴化乙锭,同时嵌入在核酸碱基间的溴化乙锭吸收302nm和366nm波长的紫外线,来自两方面的能量最终激发出波长为590nm的红橙色的可见荧光。通常用水将EB配制成l mg/mL的贮存液,于室温下避光保存。该染料通常以0.5 μg/mL的浓度掺人到凝胶和缓冲液里,电泳后直接观察。也可在不加EB的条件下进行凝胶电泳,电泳完成后将凝胶浸在含EB(0.5 μg/mL)的电泳缓冲液或水中,于室温下染色20 min左右后观察。EB的存在将使线状双链DNA的电泳迁移率降低近15%。应该注意的是,溴化乙锭是强诱变剂,并有中度毒性,取用这种染料的溶液时务必带上防护手套。如不慎与皮肤接触,应立即用清水彻底冲洗,含有溴化乙锭的溶液在使用后,不得随意丢弃。

出于安全性的考虑,本实验对凝胶的染色未采用溴化乙锭,而是选择了更加安全低毒的GoldViewTM核酸染料。它是一种新型的核酸染料,采用琼脂糖电泳检测DNA时,GoldView与核酸结合后能产生很强的荧光信号,其灵敏度与EB相当,使用方法与之完全相同。

经过荧光染料染色后的凝胶,在暗室条件下,经过紫外灯照射激发可以出现相应的可见荧光。实验者可通过肉眼或仪器进行观察,紫外线投(反)射仪原理如图。随着科技的发展,各种自动化很高的相关仪器,设备相继问世。这些先进仪器的使用使得测量结果更加接近真实值,凝胶扫描仪和图像分析系统就是具有代表性的仪器。凝胶扫描仪主要用来对样品单向电泳后的区带进行扫描,从而得出定量的结果。凝胶扫描仪的出现大大缩短了电泳结果的分析时间,更主要的是提高了电泳结果分析的准确性。扫描仪所得的图谱通过计算机进一步进行数据加工处理,提高了数据的分辨率、准确度和灵敏度,特别是在背景扣除、积分方法等数据处理上可以根据情况来选定,从而使得测量结果与真实情况更加接近。而图像分析系统将凝胶谱图摄制下来,进一步将信息数字化,同时输入到计算机中再进行分析,使测定结果更加迅速、精确。现在的凝胶成像以及图像分析系统不但可以做蛋白质定量,而且也可以做荧光和放射自显影测量,大大地推动了分子生物学的研究进展。凝胶扫描仪的原理和结构与分光光度计基本一致。其结构分为光源、单色器(或滤光片)、样品室、光电倍增管、结果显示等几部分。样品室是为专门放置凝胶板而设计的。根据设置的不同光源,扫描仪可有不同的功能,如为紫外光源,可以扫描未经染色的凝胶。而采用可见光源的扫描仪只能对于染色凝胶进行检测。根据扫描仪视光路的不同,有透射方式测定和反射方式测定两种,前者能扫描可以透光的凝胶,而后者因光束方向可以改变,则可以扫描不透明的电泳转移膜、层析板等。

5 / 13

2.4大肠杆菌及质粒载体

大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是革兰氏阴性短杆菌,大小0.5×1~3微米。周身鞭毛,能运动,无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气,是人和动物肠道中的正常栖居菌,婴儿出生后即随哺乳进入肠道,与人终身相伴,其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长,减少蛋白质分解产物对人体的危害,还能合成维生素B和K,以及有杀菌作用的大肠杆菌素。它的主要特点有以下几点:1、大肠杆菌是细菌,属于原核生物;具有由肽聚糖组成的细胞壁,只含有核糖体简单的细胞器,没有细胞核有拟核;细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。2、大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。3、人体与大肠杆菌的关系:在不致病的情况下(正常状况下),可认为是互利共生(一般高中阶段认为是这种关系);在致病的情况下,可认为是寄生。4、培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌,菌落呈深紫色,并有金属光泽,可鉴别大肠杆菌是否存在。5、大肠杆菌在生物技术中的应用:大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单,大规模发酵经济,倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛,最成功的表达体系,常做高效表达的首选体系。6、大肠杆菌在生态系统中的地位,假如它生活在大肠内,属于消费者,假如生活在体外则属于分解者。7、它的基因组DNA为拟核中的一个环状分子。同时可以有多个

6 / 13

环状质粒DNA。TOP10菌株属于大肠杆菌,它适用于高效的DNA克隆和质粒扩增,能保证高拷贝质粒的稳定遗传。

质粒载体pET系统可以使各种目的蛋白得以最优化表达。受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制;表达由宿主细胞提供的T7 RNA 聚合酶诱导。T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性:充分诱导时,几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白;诱导表达后仅几个小时,目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上,但非充分诱导时,能很容易地通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达。在非诱导条件下,可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因,即可避免因目的蛋白对宿主细胞的可能毒性造成的质粒不稳定。

3 实验材料

3.1 主要器材

电子天平,冰箱,超净工作台,摇床,高速离心机,旋涡振荡器,制冰机,微量移液器,微量离心管,微波炉,琼脂糖凝胶电泳仪(DYY-6C型,北京市六一仪器厂),紫外凝胶成像系统(DNR Bio-Imaging Systems),封口膜,一次性手套。

3.2 主要试剂

(1)

菌种:含有PET28a质粒的大肠杆菌Top10,卡纳霉素抗性。含有pUC18质粒的大肠杆,菌氨苄青霉素抗性。 (2) (3) (4)

LB液体培养基:酵母浸膏5 g/L,胰蛋白胨10 g/L,NaCl 10 g/L,pH 7.0 卡纳霉素:100 mg/mL

Plasmid mini kit质粒小量提取试剂盒(Biomiga公司)

(5) 琼脂糖:电泳级

(6) DNA Marker IV,由6条线状双链DNA条带组成,分别为7000、5500、3500、

2000、1000和500bp

(7) GoldViewTM核酸染料(赛百盛)

(8) TAE溶液:40 mmol/L Tris-乙酸盐,1 mmol/L EDTA (9) 10×点样缓冲液(Loading Buffer, Takara)

4 实验方法

4.1菌体培养(前期准备工作)

将50μL甘油中保存的菌液接入固体LB平板37②过夜培养,挑取单菌落接入10mL液体LB培养基(其中卡纳霉素的浓度为50 ug/mL),37②,200rpm过夜培养。

7 / 13

4.2质粒提取

按照Plasmid mini kit质粒小量提取试剂盒(Biomiga公司)进行操作:

1. 37℃过夜培养的菌液1~4 mL 13000 rpm离心1 min,收集菌体,并尽可能的去除上清,以防止后面菌液裂解不充分和沉淀不完全的情况;

2. 使用250 μl Buffer A1充分重悬沉淀;

3. 加入250 μl BufferB1后反转离心管使液体混合均匀,然后静置4 min,最好出现溶液粘稠且澄清的现象,否则可以考虑加大B1的量或者减少菌液的量;

4. 加入350 μl 冰箱预冷的Buffer N1后立即反转多次至溶液充分混匀,出现白色絮状沉淀后放置于冰浴上静置2min;

5. 室温下13000 rpm离心10 min,一次到多次直至上清中没有沉淀为止,然后将上清转入带有已平衡好的DNA柱中,放置于收集管中室温下13000 rpm离心1 min,,重复两次后弃滤液;

6. 向DNA柱中加入500 μl Buffer KB,室温13000 rpm 离心1 min,倒掉收集管中的滤液;

7. 向DNA柱中加入500 μl DNA Wash Buffer,13000 rpm室温离心1 min,重复两次后弃滤液;

8. 开盖后室温13000 rpm离心5min,或者置于超净台中风干残留的乙醇,以保证最后的洗脱效率;

9. 将纯化柱置于新的1.5 ml离心管中,加入50μl预热的Elution Buffer。室温下放置2 min后13000 rpm离心1 min,重复两次后,收集洗脱液。

10. 测定得到的纯化产物的浓度,保存于-20℃冰箱中待用。

4.3 琼脂糖凝胶电泳

A 制胶

a) 利用1×TAE溶液配制1.0%琼脂糖25ml(浓度由目的条带大小决定),微波加热

使之溶化;

b) 加入2.5μL GoldView,轻轻摇匀,避免产生气泡;

c) 将制胶床放入水平放置的制胶托盘中,插好梳子,倒入融好的琼脂糖凝胶; d) 待凝胶充分凝固(30min)后,拔下梳子。 B 加样

e) 将制胶床连同凝胶一起放入电泳槽中;

f) 加入电泳缓冲液TAE,浸没胶面1mm左右;

g) 10μL的样品和2μL点样缓冲液在封口膜上混和,然后点在点样孔中; h) 将4μL 的DNA Marker点在点样孔中。 C 电泳

i) 盖上透明上盖;

j) 接通电源线,选择工作电压,120V,30min,打开电泳开关;

k) 当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段的距离时,关闭电源,将

凝胶在紫外灯下观察,并用凝胶成像系统成像保存电泳图。(请注意观察,如溴酚蓝已经接近另一端时可及时停止)

l) 如需要进行切胶回收,需要尽量保证目的DNA片段暴露在紫外灯下的时间比

较短。

8 / 13