化工专业实验

实验名称 质粒DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳 班级 化21 姓名 张腾 学号 2012011864 成绩 实验时间 2014.12.26 同组成员 王乙汀、陈秉伦、梁有向

1 实验目的

（1）掌握碱裂解法提取质粒的原理和方法

（2）掌握琼脂糖凝胶电泳分离鉴定DNA的原理和方法。

2 实验原理

2.1质粒

质粒（plasmid）是在细菌中以独立于染色体之外的方式存在，是细菌染色体外的小型双链环状DNA复制子。理论上讲，所有的细菌株系都含有质粒，有些质粒携带有帮助其自身从一个细胞转入另一个细胞的信息，即F质粒，有些则表达对一种抗生素的抗性，即R质粒，还有一些携带的是参与或控制一些不同寻常的代谢途径的基因即降解质粒。质粒的大小不定，小的不到1kb，大的超过500kb，每个质粒都有一段DNA复制起始点的序列，它帮助质粒DNA在宿主细胞中复制。对细菌的某些代谢活动和耐药性表型具有一定的作用。目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或 Sal I切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。pSC101与pBR322相似，只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点。质粒运载体的最大插入片段约为10 kb(kb表示为千碱基对)。

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图1. 质粒作为载体在基因工程中的应用

应用质粒作为基因克隆的载体分子，携带外源基因进入细菌体内进行扩增或表达，一个重要前提条件是要获得批量纯化的质粒DNA分子。质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解。在质粒DNA的分离和纯化过程中，毫无疑问，宿主细胞的裂解是分离质粒DNA实验操作的关键步骤。常用的质粒DNA分离方法有3种：碱裂解法、煮沸法和去污剂裂解法。前两种方法比较剧烈，它们可以破坏碱基配对，使宿主细胞的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA由于拓扑缠绕，两条链不会互相分离。当外界条件恢复正常时，质粒的DNA双链又迅速恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，其大小范围在1KB至200kb以上不等。所以，质粒DNA提取与纯化是最基本的分子生物学实验技术，其中，碱裂解法提取的质粒产量高、纯度好，是一种最为常用的方法。

2.2碱裂解法

碱裂解法提取质粒的实验原理是在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，收集上清即可得到富集的质粒DNA。

近年来，随着基因治疗和DNA疫苗的发展，质粒逐渐成为一种新型的生物大分子医药产品，药用质粒的大规模制备成为生物下游过程的重要研究课题。

采用此碱裂解法制备高拷贝数质粒（如pUC系列）时，质粒DNA的产量通常约为3～5μg/ml菌液。随着生化技术的发展，市场上出现了商品化的试剂盒用于提取及纯化质粒，有些试剂盒采用了传统的SDS碱裂解法，结合DNA制备膜技术，具有高效、快速、方便之特点。还有些试剂盒利用层析的原理纯化质粒DNA，DNA分子中磷酸二酯链骨架在高盐作用下脱水，使得暴露的磷酸基团吸附硅胶，经水溶性缓冲液重新水化后，DNA能从层析柱上回收。大多数试剂盒分离纯化的原理为先使经过分离的质粒DNA吸附在柱或膜上，然后常规用乙醇洗涤，最后用水将吸附在柱上或膜上的DNA用水溶解下来。实验中采用的普通质粒提取试剂盒为Tiangen 普通质粒小提试剂盒。

下图为质粒DNA制备的原理。

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图 质粒DNA制备原理

2.3凝胶电泳

电泳技术是分离、纯化DNA和鉴定DNA大小的重要方法。生物大分子如核酸、蛋白质、多糖等，在一定的pH条件下，可以解离成带电荷的离子。在电场中这些带电荷的离子，可以根据电荷的性质向正极或负极移动。这种带电荷物质在电场中向其相反电极泳动的现象称为电泳。在电泳过程中通常要考虑泳动率，泳动率又称迁移率，是指带电荷颗粒单位时间荷单位电场强度下，在电泳介质中泳动的距离。泳动率与样品分子荷电密度、电场中电压及电流成正比，与样品的分子大小、电泳介质黏度与电阻成反比。不同大小的带电分子具有不同的泳动率。不同的电泳介质具有对样品不同的分辨效果。在进行核酸电泳时，注意DNA分子的构象，在分子质量相同时，以高度超螺旋的DNA泳动速度最快，随着超螺旋程度降低，相应DNA泳动速度依次变慢，最慢者为线状双链DNA。在通常情况下，线状DNA分子在一定浓度琼脂糖介质中泳动的速度与其分子质量的对数成反比。因此，利用DNA分子长度（bp）的负对数与泳动距离作图，对于DNA片断分子质量测定方便而准确。缓冲液是电场中的导体，其种类、pH及离子强度会直接影响电泳效果。通常要选择缓冲离子泳动速

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度应和样品的泳动速度一致，否则会引起带型不均一或不对称峰的出现。在分离核酸时，常选用较高的pH值，使样品带负电荷，在电场中向正极泳动。以电泳支持介质主要可以分为聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶，以电泳方式可以分成垂直型和水平型。一般来说，聚丙烯酰胺凝胶电泳用来分离较短的核酸片断（5～500bp），分辨率高于琼脂糖凝胶电泳，而后者多用于0.1～60kb的较大核酸片断。垂直型电泳装置分离效果比水平型略好，多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。水平型电泳几乎为所有的琼脂糖电泳所采用，其优点是灌胶、制板及加样等操作都较为方便且不会因机械压力引起低浓度凝胶的破裂。

图.水平电泳装置结构示意图

琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便、快速，分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至50kb的DNA。

琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线型高聚物。琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化形成清澈、透明的溶液，然后将溶液倒人胶模中，令其凝固。凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。在外加电场作用下，带负电荷的DNA分子向阳极迁移，迁移速率由以下参数决定：①DNA的分子大小；②琼脂糖浓度；②DNA的构象；②所加电压；②电场方向；②碱基组成与温度；②嵌入染料的存在；②电泳缓冲液的组成。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为受DNA的碱基组成或凝胶电泳温度的影响不明显，琼脂糖凝胶电泳一般在室温下进行。琼脂糖浓度和所加电压对迁移速率的影响比较值得注意。一个给定大小的线状DNA片段，其迁移速率在不同浓度的琼脂糖中各不相同，采用不同浓度的凝胶有可能分辨长度范围广泛的DNA分子。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是，随着电场强度的增大，高分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长。因此，随着电压的增大，琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小。

图. 电泳上样示意图

样品经电泳后形成的条带必须经过染色后才能被显示出，以进行分析和检测。观察琼脂糖凝胶中DNA的最简便方法是利用荧光染料进行染色。荧光物质含有一个可以嵌入DNA

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