第一章 无菌操作技术实践

知识系统构建

必背要语

1.细菌培养基的配制过程：配制培养基→调节pH→分装→包扎→灭菌→搁置斜面。 2.消毒和灭菌的实质不同：前者只杀死绝大多数微生物，后者则杀死所有的微生物。 3.微生物的接种方法有穿刺接种、斜面接种、涂布平板接种和平板划线接种。

4.用涂布平板法形成的细菌菌落通常仅在平板表面生长，而混合平板法形成的细菌菌落出现在平板表面及内部。

5.微生物分离的原理是提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物生长。方法是使用选择培养基。

6.统计菌落数目的方法可分为活菌计数法和显微镜直接计数法。前者的原理是涂布平板法接种，一个菌落代表一个单细胞；后者的原理是利用血球计数板，在显微镜下计数。 脱分化再分化分化

7.植物组织培养的基本过程：外植体――→愈伤组织――→胚状体――→试管苗。 8.生长素、细胞分裂素是启动生长、细胞分裂、脱分化、再分化的关键激素。进行组织培养时要配备三种培养基，分别是愈伤组织形成培养基、诱导生根培养基和诱导生芽培养基。 9.天竺葵的组织培养过程：准备(器具准备、试剂准备)→配制培养基→灭菌→取材与接种→观察与记录→转接培养。

规律方法整合

整合一 微生物的纯培养技术与无菌操作技术 1.微生物的纯培养技术

(1)自然环境中的微生物是混杂在一起的，因此分离获得纯培养物的基本原理：首先采用一定方法将单个的细胞与其他细胞分离开，进而提供细胞合适的营养和条件，使其生长成为可见的群体。

(2)微生物的分散主要采用稀释的方法，而固体培养基能够使分散的细胞固着于一定的位置，与其他的细胞分离，从而生长成为一个单细胞来源的群体即纯培养物。

①平板划线法：将合适的无菌培养基倒入无菌培养皿中，冷却后制备成平板。平板划线法中细胞的分离和稀释过程发生在接种环在固体平板表面上的划线和移动过程中，产生的单个细胞在培养基表面生长的后代就是纯培养物。

②涂布平板法：该法用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，最常用的液体稀释方法为10倍系列稀释，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。然后，将灭完菌冷却到45～50 ℃的培养基倒入无菌培养皿中冷却形成平板，然后选择细胞得以分散的合适稀释度的菌悬液加到平板中央，以玻璃涂布器将之均匀地涂布于整个平板上培养即可。 2.无菌操作要求

(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。 (2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。

(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。 (4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

例1 某化工厂的污水池中含有一种有害的难以降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功筛选到能高效降解化合物A的细菌(目的菌)。

实验的主要步骤如图所示，请分析回答下列问题：

(1)培养基中加入化合物A的目的是____________，这种培养基属于____________培养基。 (2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的______________。实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的代谢类型是________________。

(3)在上述实验操作过程中，获得纯净“目的菌”的关键是________________。

(4)转为固体培养基时，常采用平板划线法进行接种，此过程中所用的接种工具是________________，操作时采用____________灭菌的方法。 (5)如何确认培养基是否合格？

________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案 (1)筛选目的菌 选择 (2)化合物A 异养需氧型 (3)防止外来杂菌污染 (4)接种环 灼烧 (5)不接种的空白培养基与接种培养基一起培养，用以证明培养基制备过程中是否被杂菌污染

解析 欲筛选可降解有机物A的微生物，需配制只以有机物A为唯一碳源的选择培养基，以保障目的菌的生长，抑制非目的菌的生长繁殖；若需“振荡”培养，表明该目的菌为好氧型菌；平板划线接种的工具为接种环，使用前后均需灼烧灭菌。 整合二 细胞的全能性

1.概念：细胞的全能性是指已经分化的细胞仍然具有发育成完整个体的潜能。

2.原因：构成生物体的所有体细胞都是由受精卵通过有丝分裂发育而来的，含有相同的遗传物质，都含有本物种的所有遗传信息，因此每个体细胞都有发育成完整个体的潜能。生物的生殖细胞在一定条件下也具有全能性，是因为生殖细胞中含有本物种生长发育的全部遗传信息，尽管其遗传物质是体细胞的一半。

3.表达的条件：由于基因的选择性表达，细胞的全能性在植株上受到限制不能表达，只有在离体条件下，在营养、激素和其他条件适宜的情况下，细胞才能表达其全能性。动物细胞难以表达其全能性，但是通过核移植后，细胞核仍可表达其全能性。

4.表达的难易程度：植物细胞全能性易表达，而动物细胞的全能性不易表达，但动物细胞核的全能性可以表达。在所有细胞中，受精卵可直接发育为个体，有的生殖细胞也可在一定条件下表达其全能性。

5.意义：细胞全能性是植物组织培养和体细胞杂交的理论基础，也是现代动物体细胞克隆技

术的理论基础。

例2 下列实例中能体现细胞全能性的是( )

①用悬浮培养的胡萝卜单个细胞培养成可育的植株 ②植物用种子繁殖后代 ③用烟草组织培养的单个细胞形成了可育的完整植株 A.①② B.①③ C.②③ D.①②③ 答案 B

解析 细胞的全能性是指已经分化的细胞仍具有发育成完整个体的潜能。其中①和③都属于由已经分化的细胞经过培养形成可育的植株，体现了细胞的全能性。用植物种子繁殖后代，实际上就是一个受精卵通过细胞的增殖和分化发育成新个体，所以是由未分化的细胞(受精卵)发育成新个体的过程，不能体现出细胞的全能性。 整合三 植物组织培养易混点辨析 1.植物组织培养的四种培养基 (1)基础培养基——MS培养基

①母液：大量元素、微量元素、铁盐、有机物等； ②其他成分：蔗糖、琼脂； ③pH：5.6～5.8。

(2)诱导愈伤组织形成的培养基

MS＋0.5 mg/L 6－BA＋0.125 mg/L 2,4－D (3)诱导分化芽的培养基

MS＋1.0 mg/L 6－BA＋0.1 mg/L NAA (4)诱导生根的培养基 MS＋0.1 mg/L NAA

2.植物组织培养中不使用天然激素的原因：组织培养时不用天然激素而是用人工合成的植物生长调节剂，是因为植物中存在相应的分解天然激素的酶而没有分解相应的人工合成的植物生长调节剂的酶，所以天然激素在植物体内作用和存在的时间短，人工合成的植物生长调节剂的作用和存在的时间长，作用效果明显。

3.天竺葵组织培养中愈伤组织形成及生根、生芽期间均需在15～25 ℃光照强度为1 000～2 000 lx的条件下，每天光照12 h进行培养。

4.无菌技术是植物组织培养成功的关键：植物组织培养不同于扦插、压条等常规的无性繁殖。由于植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，所以对培养条件的要求较高，对无菌操作的要求非常严格。若不小心引起污染，将可能造成培养工作前功尽弃，因此实验过程始终贯穿着灭菌消毒。对培养材料表面进行灭菌时，一方面要考虑药剂的消毒效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。不同药剂、不同植物材料，甚至不同器官都要区别对待。 例3 1958年，美国科学家将胡萝卜韧皮部的细胞培养产生完整植株，如下图所示，请回答