NH3+ OH- NH3+ OH- NH2 Pr Pr Pr COOH H COO- H COO- ++ 图2-16 蛋白质分子的两性解离
在等电点时，蛋白质兼性离子带有相等的正、负电荷，成为中性微粒，在电场中不移动。并且不稳定而易于沉淀。
二、蛋白质的胶体性质
蛋白质是高分子物质，其分子量介于一万到百万之间，最大者可达数千万。蛋白质在溶液中形成的颗粒直径大约1~100nm，属于胶体颗粒的范围，所以蛋白质溶液是胶体溶液（图2-17）。
图2-17 蛋白质胶体溶液
蛋白质形成的胶体颗粒的稳定因素主要是分子表面的水化层和电荷层。在蛋白质表面有不少的亲水基团，能与水发生水合作用，水分子受蛋白质极性基团的影响，定向排列在蛋白质分子的周围，形成水化层，将蛋白质颗粒分开，不致相
聚而沉淀。在偏离等电点的溶液中，形成电荷层，同性电荷相斥，防止蛋白质颗粒相聚沉淀。因此蛋白质易溶于水，是稳定的亲水胶体。如果破坏水化膜和电荷，蛋白质则因分子间引力增加聚集而沉淀。蛋白质分子聚集从溶液析出的现象称蛋白质的沉淀。沉淀出来的蛋白质有时是变性的，但如控制实验条件（如低温和使用温和的沉淀剂），便可得到不变性的蛋白质沉淀。 三、蛋白质的变性、沉淀和凝固
蛋白质在某些理化因素作用下，其特定空间结构被破坏从而导致理化性质改变和生物学活性丧失，这种现象称蛋白质的变性。
使蛋白质变性的物理因素有高温、高压、超声波、紫外线、X射线等；化学因素有强酸、强碱、浓乙醇、重金属离子、尿素、去污剂等。蛋白质变性时，空间结构剧烈变化，而不涉及一级结构改变或肽键的断裂。即蛋白质变性的实质是由于维系蛋白质空间结构的次级键被破坏，导致蛋白质空间结构破坏，多肽链成为松散状态。原本隐藏在分子内部疏水基团暴露，促使蛋白质的溶解度降低，因此变性的蛋白质易沉淀，但是维系蛋白质胶体溶液的因素除开表面水化层还有表面的电荷，如果变性的蛋白质的溶液的PH远离其PI，此时蛋白质仍不易沉淀。变性蛋白质在ＰＨ接近等电点状态易聚集而沉淀。例如，煮沸牛奶，其酪蛋白已变性，但并不沉淀；酸牛奶的ＰＨ已接近有关蛋白质的pI，煮沸后蛋白质即结絮沉降。天然蛋白质或等电点状态的变性蛋白质经加热煮沸，多肽链相互缠绕，即可变为较坚固的凝块，这种现象称为蛋白质凝固作用。天然蛋白质结构紧凑，不易被酶水解，而变性蛋白质，因肽键暴露易被酶水解。这就是熟食比生食易消化的原因。
变性蛋白质除溶解度降低及易被消化外，最主要的特点是其生物学活性的丧失。如酶的催化活性，抗原抗体的特异性反应，血红蛋白的运输Ｏ2和ＣＯ2的功能，毒素的致毒作用等都可丧失。大多数蛋白质变性后，不能恢复其天然状态，有些蛋白质变性后，如设法将变性剂除去，该变性蛋白质尚能恢复其原有结构和活性、这称为蛋白质的复性。例如用脲素和β－巯基乙醇作用于核糖核酸酶，可使该酶的天然构象破坏，失去生物学活性，去除脲素和β－巯基乙醇，该酶的活性又逐渐的恢复。可见蛋白质变性并不是不可逆的；变性的蛋白质是否可复性，主要取决于变性程度，例如凝固的蛋白质是不可逆的。
蛋白质的变性在临床医学上具有重要意义。如采用高温、高压、紫外线、酒精使病原微生物蛋白质变性，失去致病性和繁殖能力。在保存血清，疫苗抗体等生物制品时，应当保存在低温条件下，防止剧烈振荡及强光照射，避免强酸、强碱、重金属的污染，以防止蛋白质的变性失活。
破碎组织和细胞，将蛋白质溶解于溶液中的过程称为蛋白质的提取。将溶液中蛋白质相互分离而取得单一蛋白组分的过程称为蛋白质的纯化。蛋白质的各种理化性质和生物学性质是提取与纯化的依据。 （一）改变蛋白质的溶解度
通过改变蛋白质的溶解度沉淀蛋白质的常用方法有盐析和有机溶剂沉淀。此外还有调节pH和改变温度等方法。
盐析是在蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐（NH4）Na2SO4 、NaCl等，2SO4、使蛋白质从溶液中析出的现象。中性盐在水中溶解性，亲水性强大，与蛋白质争夺与水结合，破坏蛋白质的水化层。另外中性盐又是强电解质，解离作用强，能中和蛋白质的电荷，破坏蛋白质的电荷层。因此稳定蛋白质溶液的因素遭到破坏，蛋白质溶解度下降从溶液中析出。盐析法沉淀蛋白质并未破坏蛋白质天然状态，沉淀出的蛋白质可不变性，因此盐析法是分离制备蛋白质或蛋白类生物制剂的常用方法。如用饱和硫酸铵可使血浆中清蛋白沉淀出来，而球蛋白则在半饱和硫酸铵溶液中析出。混合蛋白质溶液可用不同的盐浓度可使其分别沉淀，这种分级沉淀的方法称为分段盐析。
有机溶剂沉淀法：酒精、甲醇、丙酮等能破坏蛋白质的水化膜使蛋白质沉淀，在等电点时沉淀的效果更好。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质可引起蛋白质变性，酒精消毒灭菌就是如此，但是在低温下，蛋白质变性速度减慢，因此，用有机溶剂沉淀蛋白质时，为防止蛋白质的变性，常需在低温条件下快速进行。 （二）根据蛋白质分子大小不同的分离方法
各种蛋白质分子具有不同的分子量和形状，可采用离心、超滤和凝胶过滤等技术将其分离。
1．离心 离心分离是利用机械的快速旋转所产生的离心力，将不同的物质分离开来的方法。蛋白质溶液在高速离心时，由于离心力的作用，蛋白质会下沉，这就是蛋白质的沉降现象。蛋白质分子在单位力场的沉降速度称沉降系数（S）。
通常情况下，分子量愈大，沉降系数愈高，沉降愈快。因此，可以用高速离心的方法来分离蛋白质混合溶液中的不同蛋白质。
2．透析和超滤 蛋白质溶液具有胶体溶液的性质，如溶液扩散慢，粘度大，不能透过半透膜。将蛋白质放入半透膜内，小分子物质可透过半透膜，蛋白质分子仍保留在半透膜内，这种方法称透析法。这是纯化蛋白质最简单的方法。利用透析法可除去蛋白质溶液中的无机盐等小分子物质。
超滤是利用超滤膜在一定压力下使大分子蛋白质滞留，而小分子物质和溶剂滤过。可选择不同孔径的超滤膜以截留不同相对分子质量的蛋白质。此法的优点是选择的相对分子质量范围内进行分离，没有相态变化，有利于防止变性。这种方法既可以纯化蛋白质，有可以达到浓缩蛋白质溶液的性质。
3．凝胶过滤层析 凝胶过滤是按照天然蛋白质相对分子质量大小进行蛋白质分离的技术，又称分子筛层析或排阻层析。在层析柱内填充惰性的微孔胶粒（交联葡聚糖），将蛋白质溶液加入柱上部后，小分子物质通过胶粒的微孔进入胶粒，向下流动的路径加长，移动缓慢；大分子物质不能或很难进入胶粒内部，通过胶粒间的空隙向下流动，其流动的路径短，移动速率较快，从而达到按不同相对分子质量将溶液中各组分分开的目的。 四、蛋白质的紫外吸收性质
蛋白质分子中常含酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，在280nm紫外光谱处，有特征性的最大吸收峰。因此，280nm紫外光的吸收值常用于蛋白质的定量测定。 五、蛋白质的呈色反应
（一）茚三酮反应(Ninhydrin Reaction)
α－氨基酸与水化茚三酮(苯丙环三酮戊烃)作用时，产生蓝色反应，由于蛋白质是由许多α－氨基酸组成的，所以也呈此颜色反应。 （二）双缩脲反应(Biuret Reaction)
蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，称双缩脲反应。凡分子中含有两个以上－CO－NH－键的化合物都呈此反应，蛋白质分子中氨基酸是以肽键相连，因此，所有蛋白质都能与双缩脲，而氨基酸因无肽键则无此反应。 试剂发生反应。
（三）米伦反应(Millon Reaction)