PI 染色操作步骤 下载本文

PI 染色操作步骤

1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中,离心,1500rpm , 5min,弃上清液。 2、加入PBS 1ml离心洗涤1次,弃上清。

3、加入2ml预冷的70%酒精,4℃固定30min,或是-20℃固定过夜。 4、离心,弃上清液。

5、用1×PBS 1ml洗涤1次,离心。

6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中,37℃孵育30min,离心。 7、用1×PBS 1ml洗涤1次,离心。

8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中,室温避光孵育30min。 9、混匀,过300目筛网,置流式管中, 4℃冰箱保存,待测。

GFP PI染色操作步骤

1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中,离心,1500rpm , 5min,弃上清液。 2、加入PBS 1ml离心洗涤1次,弃上清。

3、加入2ml预冷PFA,PFA的浓度根据细胞的特点进行调节,4℃固定30min。 以下步骤同PI 染色操作步骤的(4-9) 细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤

1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中,离心,1500rpm,5min,弃上清液。 2、以冷PBA 1ml,离心洗涤,弃上清液。

3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。用微量移液器轻轻吹打混匀,4℃或置冰上孵育30min-1h。 4、离心弃上清液。

5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次,以除去未结合的多余抗体成分。

6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀,置流式管中,4℃避光保存,待测。

细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤

1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤

3、 用PBA稀释的第一抗体200ul,对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG,轻轻吹打混匀,4℃或置冰上孵育1.5-2h。离心,弃上清。

4、 BS1ml离心洗涤1次,以去除多余的未结合的特异性抗体。

5、 PBA适当稀释的荧光素标记的第二抗体200ul。吹打混匀,4℃或置冰上孵育30min,避光。

6、 PBS 1ml离心洗涤2次。

7、将细胞重新悬浮于500ulPBS中,混匀,置流式管中,避光,4℃冰箱保存,待测。

胞内直接免疫荧光染色操作步骤

1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中,离心,1500rpm , 5min,弃上清液。 2、用1×PBS1ml洗涤1次,离心。 3、4%PFA 1ml,4℃固定30min。 4、用1×PBS1ml洗涤1次,离心。 5、0、1% Triton-100 1ml, 室温10min。 6、用1×PBS1ml洗涤1次,离心。

7、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul,用微量移液器轻轻吹打混匀,4℃或置冰上孵育30min-1h。

8、离心弃上清液。

9、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次,以除去未结合的多余抗体成分。

10、向细胞中加入冷PBS500ul,吹打混匀,置流式管中,4℃避光保存,待测。

胞内间接免疫荧光染色操作步骤

1-6、同胞内直接免疫荧光染色操作步骤

7、加入用PBA稀释的第一抗体200ul,对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG,轻轻吹打混匀,4℃或置冰上孵育1、5-2h。离心,弃上清。

8、冷PBS1ml离心洗涤1次,以去除多余的未结合的特异性抗体。

9、加入PBA适当稀释的荧光素标记的第二抗体200ul。吹打混匀,4℃或置冰上孵育30min,避光。

10、冷PBA1ml离心洗涤2次。

11、将细胞重新悬浮于500ulPBS中,混匀,置流式管中,避光,4℃冰箱保存,待测。 备注:

1、RNase A:贮液浓度:1mg/ml; 工作液配制:加1 mg/ml贮液 10ul于500ul 1×PBS中,使终浓度为 20ug/ml。

2、PI:贮液浓度:2、5mg/ml; 工作液配制:加2、5 mg/ml贮液 10ul于500ul 1×PBS中,使终浓度为 50ug/ml。

3、PBA:即PBS加1-2% 牛血清白蛋白,加0、1%叠氮钠。 4、检测样品细胞浓度1x106 /ml。