药物分析化学实验指导
实验一 葡萄糖的杂质检查
一、目的要求
1、了解药物的一般杂质检查的项目和意义。
2、掌握葡萄糖中一般杂质限度检查的项目和限量计算方法。
3、掌握葡萄糖中氯化物、硫酸盐、铁盐、重金属、砷盐、炽灼残渣限量检查的基本原理和方法。 二、基本原理
1、氯化物检查法 Cl?3?AgNO????AgCl?(白) 3HN0 所生成的浑浊液与一定量的标准液在同样条件下生成的浑浊液相比较，以判断本品中含氯化物的限量。 2、硫酸盐检查法
2? SO4?BaC2l????BaSO4?(白)
HCl 与一定量的标准溶液在同一条件下生成的硫酸钡浑浊比较, 以判断本品中含硫酸盐的限量。
3、铁盐检查法
Fe3??6SCN????? [Fe(SCN)6]H?3? 红色
与一定量标准铁溶液用同法处理后进行比色。 4、重金属检查法
CH3CSNHPd2?2?H2O?CH3CONH2?H2S?H2S?PdS? 黑色可与对照标准液按同法处理比较。 5、砷盐检查法
AsO3?3Zn?9HAsHAsH333???AsH3??3Zn2??3H2O?2HgBr?3HgBr22?2HBr?AsH(HgBr)2 黄色?3HBr?As(HgBr)3 棕色与定量标准砷溶液所生成的砷斑比较。 6、干燥失重测定法
干燥失重是指药物在规定的条件下经干燥后所减失的重量，根据减失的重量和取样量计算供试品干燥失重的百分率。干燥失重检查法主要控制药物中的水分,也包括其它挥发性物质如乙醇等。
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三、实验材料
葡萄糖 氢氧化钠（0.02mol/L） 酚酞指示剂 90%乙醇 硝酸 稀硝酸 硝酸银试液 标准氯化钠溶液 盐酸 稀盐酸 标准硫酸钾溶液 25%氯化钡 碘试液 硫氰酸铵溶液 标准铁溶液 标准铅溶液 醋酸盐缓冲液（PH3.5） 硫代乙酰胺试液 稀硫酸 溴化钾试液 碘化钾试液 酸性氯化亚锡试液 醋酸铅棉花 溴化汞试纸 标准砷溶液 磺基水杨酸溶液 试(检)砷器 水浴 四、操作方法
1. 酸度 取本品2.0g，加水20ml溶解后，加酚酞指示液3滴与氢氧化钠滴定（0.02 mol/L）0.20ml，应显粉红色。
2. 溶液的澄清度与颜色 取本品5g，加水溶解后，放冷，用水稀释至10ml，溶液应澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液（附录ⅣB）比较，不得更深；如显色，与对照液（取比色用氯化钴液3ml、比色用重铬酸钾液3ml与比色用硫酸铜液6ml，加水稀释成50ml）1.0ml加水稀释至10ml比较，不得更深。
3. 乙醇溶液的澄清度 取本品1.0g，加90%乙醇30ml，置水浴上加热回流约10分钟，溶液应澄清。
4. 氯化物 取本品0.60 g,,加水溶解使成25 ml(溶液如显碱性, 可滴加硝酸使成中性),再加稀硝酸10 ml；溶液如不澄清,应滤过；置50 ml纳氏比色管中,加水使成约40 ml,摇匀,即得供试液。另取标准氯化钠溶液(10μg Cl/ml)6.0 ml,置50 ml纳氏比色管中,加稀硝酸10 ml, 加水使成约40 ml,摇匀,即得对照品。于供试液与对照液中,分别加入硝酸银试液1.0 ml,用水稀释使成50 ml,摇匀,在暗处放置5分钟,同置黑色背景上,从比色管上方向下观察、比较，供试溶液不得比对照溶液更浓(0.010%)。
5. 硫酸盐 取本品2.0ｇ,加水溶解使成约40 ml(溶液如显碱性,可滴加盐酸使成中性)；溶液如不澄清，应滤过；置50 ml纳氏比色管中, 加稀盐酸2 ml，摇匀，即得供试溶液。另取标准硫酸钾溶液(100μg SO42-/ml)) 2.0ml置50 ml纳氏比色管中，加水使成约40 ml, 加稀盐酸2 ml，摇匀，即得对照溶液；于供试溶液与对照溶液中，分别加入25%氯化钡溶液5 ml, 用水稀释使成50 ml，充分摇匀，放置10分钟, 同置黑色背景上, 从比色管上方向下观察、比较，供试溶液不得比对照溶液更浓(0.010%)。
6. 亚硫酸盐与可溶性淀粉 取本品1.0g，加水10ml溶解后，加碘试液1滴，应即显黄色。
7. 铁盐 取本品2.0ｇ,加水20 ml溶解后,加硝酸3滴, 缓缓煮沸5分钟, 放冷, 加水稀释成45 ml，加硫氰酸铵溶液（30→100）3 ml，摇匀，如显色，与标准铁溶液2.0 ml用同一方法制成的对照液比较,不得更深(0.001%)。
8. 重金属 取50 ml纳氏比色管两支, 甲管中加标准铅溶液(10μg Ｐｄ/ml))一定量与醋酸盐缓冲液(pH3.5) 2 ml后,加水稀释成25 ml。取本品4.0ｇ，置于乙管中，加水23 ml溶解后，加醋酸盐缓冲液(pH3.5) 2 ml；若供试品带颜色, 可在甲管中滴加少量的稀焦糖溶液或其它无干扰的有色溶液，使之与乙管一致；再在甲 乙两管中分别加硫代乙酰胺试液各2 ml，摇匀，放置2分钟，同置白纸上，自上向下透视，乙管中显出的颜色与甲管比较，不得更深(含重金属不得过百万分之五)。
2+
－
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9. 砷盐 取本品2.0ｇ置试砷瓶中，加水5 ml溶解后，加稀硫酸5 ml与溴化钾-溴试液0.5 ml，置水浴上加热约20分钟, 使保持过量的溴存在，必要时，再补加溴化钾-溴试液适量，并随时补充蒸散的水分, 放冷, 加盐酸5 ml与水适量使成28 ml, 加碘化钾试液5 ml与酸性氯化亚锡试液5滴。在室温放置10分钟后,加锌粒2ｇ，迅速将瓶塞塞紧(瓶塞上已按好有醋酸铅棉花及溴化汞试纸的试砷器), 并在25～40℃的水溶液中反应45分钟, 取出溴化汞试纸,将生成的砷斑与标准砷溶液一定量制成的标准砷斑比较，颜色不得更深，以符合规定(0.0001%)。
标准砷斑的制备：精密量取标准砷溶液(1μｇ/ｍｌ) 2 ml, 置另一试砷器中，加盐酸5 ml与蒸馏水21 ml，照上述方法，自”加碘化钾试液5 ml…”起依法操作，即得标准砷斑。
10. 干燥失重 取本品, 混合均匀(如为较大的结晶，应迅速捣碎使成2ｍｍ以下的小粒)，分取约1ｇ，置与供试品同样条件下干燥至恒重的扁形称瓶中，精密称定，在105℃干燥至恒重。从减失的重量和取样量计算供试品的干燥失重。减失重量不得过9.5%。
11. 蛋白质 取本品1.0g，加水10ml溶解后，加磺基水杨酸溶液（1→5）3ml，不得发生沉淀。
12．炽灼残渣 取供试品1.0～2.0g，置巳炽灼至恒重的坩埚中，精密称定，缓缓炽灼至完全炭化，放冷至室温；除另有规定外，加硫酸0.5～1ml使湿润，低温加热至硫酸蒸气除尽后，在700～800℃炽灼使完全灰化，移置干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在700～800℃炽灼至恒重，即得。不得过0.1%。
五、注意事项
1．限度检查应遵循平行操作原则．即供试品与对照品的实验条件应尽可能一致，包括实验用具的选择、试剂与试液的量取方法及加入顺序、反应时间的长短等。
2．比色、比浊前应使比色管内试剂充分混匀。比色方法是将两管同置于白色背景上，从侧面或自上而下观察；比浊方法是将两管同置于黑色背景上，从上向下垂直观察。所用比色管刻度高低差异不应超过2mm，使用过的比色管应及时清洗，注意不能用毛刷刷洗，可用铬酸洗液浸泡。
3．一般情况下可取1份供试品进行检查。如结果不符合规定或在限度边缘时，对供试品和对照管各复捡2份，方可判定。 4．砷盐检查
(1)新购置的试（检）砷器使用前应检查是否符合要求，可将所有检砷器依法制备标准
砷斑，所得砷斑应显色一致，同一套仪器应能辨别出标准砷溶液1．5ml与2．0ml所呈砷斑的差异。所使用的检砷器和试药应按本法作空白试验，均不得生成砷斑或生成可辨认的斑痕。
(2)不能用定性滤纸制备溴化汞滤纸，因为所显的砷斑色暗，梯度不规律, 应采用质地疏松的定量滤纸制作。应用镊子取用溴化汞试纸, 不可用手接触生成砷斑部分。
(3)应使用干燥的导气管。
(4)锌粒的大小以通过1号筛为宜。
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(5)砷斑遇光、热、湿气即变浅或褪色。如需保存，可将砷斑在石蜡饱和的石油醚溶液中浸过晾干或避光置于干燥器内，也可将砷斑用滤纸包好夹在记录本中保存。
(6)反应时温度应保持在25～40℃。反应时间45分钟。
(7) 所取的试（检）砷器、标准管与供试管应力求一致,注意选管的长短, 自瓶内液面到溴化汞试纸之间的距离应相同, 管的内径应相同。试（检）砷器的安装加入约5cm长的醋酸铅的棉花, 置于1/2管长以上。
(8)检查中加浓溴试液的目的是氧化以破坏葡萄糖的环状结构（据有关报告，糖精钠、葡萄糖、水杨酸、磺胺等环状有机化合物如不经有机破坏，则所显砷斑均较浅），故在加热20分钟内必须保持稍过量的溴存在，20分钟后要继续加热把溴赶完，并同时作一空白作标准砷斑用。
(9) 实验中规定”按干燥品(或无水物，或无溶剂)计算”时，除另有规定外, 应取未经干燥(或末去水, 或末去溶剂)的供试品进行试验, 并将计算中的取用量按检查项下测得的干燥失重(或水分, 或溶剂)扣除。
干燥 失重%?(称量瓶?样品重)-(称量瓶?干燥后样品重(称量瓶?样品重)-称量瓶)?100%
六、思考题
1、一般杂质检查在药品质量控制中的意义及检查的主要事项？ 2、比色、比浊操作应遵循的原则？
3、古蔡氏法中成加各个试剂的作用与操作要点？
实验二 葡萄糖注射液的含量测定
一、实验目的
1．掌握比旋度的概念和旋光法测定旋光性物质含量的原理与计算方法。 2．掌握折光法测定葡萄糖注射液含量的原理与计算方法。
3．掌握快速分析法（剩余碘量法）测定葡萄糖含量的基本原理和方法。 二、实验原理
1．旋光法 葡萄糖为旋光性药物，其比旋度为+52.5°，用旋光计测出样品溶液的旋光度后，根据公式可计算含量。
c%?100?[?]LtD
25? L=2 dm [?D］?52.5~53.3
2．折光法 光线自一种透明介质进入另一透明介质时，由于两种介质的密度不同，光
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的进行速度发生变化，即发生折射现象。一般折光率系指光线在空气中进行的速度与在供试
t品中进行速度的比值。折光率以nD表示，D为钠光谱的线，t为测定时的温度。折光率与
水溶液中溶质溶液的关系可用下式表示：
nD?nD?F?PP?nD?nFttD水tt
20℃蒸馏水的折光率为1.3330，20℃葡萄糖的折光率因素为0.00142，所以测定20℃时供试液葡萄糖注射液的折光率，即可求得其含量。
3．剩余碘量法
（1）葡萄糖为一醛糖，具有还原性。在碱性介质中，过量的标准碘溶液将葡萄糖氧化成葡萄糖酸。剩余碘量法即在酸性介质中用硫代硫酸钠回滴。反应式如下：
I2 + 2NaOH → NaIO + NaI + H2O
CH2OH(CHOH)4CHO + NaIO + NaOH → CH2OH(CHOH)4COONa + NaIO + H2O 3NaIO → NaIO3 + 2NaI
（2）过量的I2一部分在氢氧化钠生成NaIO，继而进一步氧化成NaIO3，一部分由于碱量不足仍以游离碘形式存在。加酸酸化后，又全部还原以碘的形式存在。剩的碘液用酸中和后，用硫代硫酸钠标准液反滴定。
I2 + 2NaOH → NaIO + NaI + H2O 3NaIO →NaIO3 + 2NaI
NaIO3 + 5NaI + 3H2SO4 → 3I2 + 3Na2SO4 + 3H2O （3）硫代硫酸钠回滴
I2 + 2Na2S2O3 → NaI + Na2S4O6 三、仪器和试剂
仪器 自动指示旋光仪，阿培折光仪。
试剂 葡萄糖注射液，氨试液，0.1 mol/L碘溶液，1 mol/l氢氧化钠溶液，1 mol/l盐酸溶液，0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液。 四、实验步骤
1．旋光法测定葡萄糖注射液的含量 精密量取本品适量（约相当于葡萄糖10 g），置100 ml容量瓶中，加氨试液0.2 ml（10％或10％以下规格的本品可直接取样测定），用水稀释至刻度，摇匀，静置10 min，得供试液，测定旋光度。用读数至0.01并经过检定的旋光仪，将测定管（长度为2 dm）用供试液冲洗数次，缓缓注入供试液适量（注意勿使发生气
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泡），置于旋光仪内检测读数，记录旋光度，同法读取旋光度3次，取3次的平均值作为样品的旋光度。测得的旋光度与2.0852相乘，即得100 ml供试液中含有含葡萄糖。 C6H12O6?H2O的重量（g）
以含葡萄糖C6H12O6?H2O计算 标示量%???2.0852标示量?100%
药典规定含葡萄糖C6H12O6?H2O应为标示量的95.0%～105.0%。
2．折光法测定葡萄糖的含量 折光仪校正：将阿培折光仪置于光线充足的台面上，打开棱镜的锁扣。分开两面棱镜，用擦镜纸将镜面轻轻拂拭清洁后（或用少量乙醚清洁镜面，挥干乙醚），在下面棱镜中央滴加蒸馏水1～2滴，合闭棱镜，锁紧锁扣。将反射镜对准光线，调节反射镜和目镜的焦距，使目镜中十字线清晰。同时打开刻度标尺一侧圆盘上的小反光镜，使刻度标尺上读数清晰。转动补偿棱镜的旋钮，消除彩虹．使明暗分界线清晰。调节读数旋扭，使标尺读数等于测定温度时水的折光率（1.3330），然后用折光仪上带有的小钥匙，插入镜筒上小孔，轻轻旋转一定角度，使明暗交界线对准十字线交点上，小心取出小钥匙，校正完毕。若需测量在不同温度时的折射率，将温度计旋入温度计座中，接上恒温器通水管，把恒温器的温度调节到所需测量温度，接通循环水，待温度稳定十分钟后，即可测量。
样品测定：打开棱镜，轻轻擦干镜面上的水沥，滴加样品溶液1~2滴，合闭棱镜，消除彩虹，将明暗交界线对准十字线交点，从刻度标尺上读取折光率，读数应精确至小数点后第四位（最后一位为估计值）。轮流从一边再从另一边将分界线对准十字线交点，重复观察及记录读数三次，读数间的差数不应大于0.0003，取平均值计算注射液的百分含量。
按下式计算100 ml供试液中含有的C6H12O6?H2O的重量（g），并计算标示量的百分含量。
100ml中C6H12O6?H20的重量(g)?nD?nD水Ftt
3．剩余碘量法测定葡萄糖的含量 精密量取本品适量（约相当于葡萄糖75 mg），置碘量瓶中，加水稀释至5 ml，加含14.3%碳酸钠及4.0%碘化钾的溶液25 ml，再精密加入0.05 mol/L碘滴定液25 ml，密塞，在20℃准确放置30 min，加2 mol/L盐酸35 ml，并立即用0.1 mol/L硫代硫酸钠滴定液滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白试验校正。每1 ml碘滴定液（0.05 mol/L）相当于9.008 mg的无水葡萄糖（C6H12O6）或相当于9.909 mg的葡萄糖（C6H12O6·H2O）。
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五、注意事项 1．旋光法
（1）测定管两端的圆玻体，为光学玻璃片，测定前应小心用软纸擦拭，以防磨损。 （2）测定管洗净后，应用供试液荡洗几次，以确保浓度的一致。
（3）供试液应缓缓加入，不能有气泡。加好后，两头密封时勿忘加垫橡皮圈，以免泄露。
（4） 测定完毕，测定管必须立即洗涤，以免两头衬垫的橡皮圈因接触溶剂而发粘。 （5）钠光灯有一定使用寿命，连续使用时间不宜超过2 h。
（6）供试的液体或固体物质的溶液应不显浑浊或含有混悬的小粒。如有上述情形时，应预先滤过，并弃去初滤液。
（7）物质的比旋度与测定波长、溶剂、浓度和温度等因素有关，因此，表示物质的比旋度时应注明测定条件。
2．折光法 用折光计测出样品的折光率，根据公式可计算含量。
（1）定前先用擦镜纸或绸布轻轻擦拭镜面，如有必要可蘸取无水乙醚轻拭镜面，待乙醚挥干后再测定。
（2）测定过程中切勿用玻璃管或硬物接触折光仪的棱镜，以免损伤。
（3）测定完毕后，随即用滤纸条吸去供试液，然后滴加蒸馏水于棱镜上，再用滤纸条吸干（勿擦），反复洗涤三次，最后用擦镜纸轻轻擦拭干净。 3．剩余碘量法
（1）快速分析法适合于药房快速检验，其要求是速度快，检品消耗量少，效率高（定性分析只需1 min，定量分析不超过5～10 min），含量测定一般为限度测定，即在药房调配允许误差范围内，以事先所计算的上下限滴定液理论用量进行滴定，在此范围以内即可。
（2）快速定量分析不同于常量分析，取样量较少，常用容量测定法，一般固体药物取0.05～0.15 g，液体药物取0.5～2.0 ml，油膏类药物则不超过1.0 g，本实验取葡萄糖注射液（5%）1.5 ml进行分析。
（3）实验最适温度为15～30℃。 六、思考题
1．旋光仪、折光仪的结构及正确使用方法？
2．旋光法计算葡萄糖含量时，计算因素2.0852的由来？
3．在旋光分析时，为什么要加入氨试液并放置10 min后才测定旋光度？
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4．从基本原理和测定结果比较三种方法的优缺点？
实验三 维生素B1片的含量测定
一、实验目的
1.掌握差示分光光度法的原理。
2.熟悉差示分光光度法的基本测定方法。
二、实验原理
差示分光光度法（简称ΔA法）既保留了通常的分光光度法简易快速、直接读数的优点，又无需事先分离，并能消除干扰。其原理为在两种不同pH介质中或经适当的化学反应后，供试品中待测组分发生了特征性的光谱变化，而赋形剂或其他共存物质则不受影响，光谱行为不发生变化，从而消除了它们干扰。在测定时，取两份相等的供试溶液，经不同的处理（如：调节不同的pH值或加入不同的反应试剂）后，一份置样品池中，另一份置参比池中，于适
%当的波长处，测其吸收度的差值（ΔA值），根据标准曲线或?E11cm值计算出待测组分的含
量。
2005年版收载用直接分光光度法测定。
三、实验材料
维生素B1 维生素B1片 缓冲液（PH7.0） 盐酸液（PH2.0） 紫外分光光度计
四、实验方法
（一）测定波长的选择
精密称取维生素B1100mg，用水溶解并稀释成100.0ml，精密量取2ml二份，分别用缓冲液（pH7.0）和盐酸液（pH2.0）稀释成100.0ml(浓度为0.002%)，以相应溶剂为空白，测定紫外吸收光谱。再将前者放于参比池，后者放于样品池，绘制差示吸收光谱。在247nm处有最大差示吸收值（ΔA）,故确定247nm为测定波长。 （二）标准曲线绘制
精密称取干燥至恒重的维生素B1100mg, 置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。精密量取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、ml贮备液各二份，分别置100ml量瓶中。一份用缓冲液稀释至刻度，另一份用盐酸液稀释至刻度，摇匀。取上述五组浓度相同、pH不同的溶液，在247nm处分别测定差示吸收值（ΔA）以浓度C为横坐标，以差示吸收值ΔA为纵坐标绘制标准曲线。 （三）样品测定
取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量粉末（约相当于维生素B150mg）,置50ml
量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去滤液，精密量取续滤液2.0ml二份，分别置100ml量瓶中，分别用缓冲液和盐酸液稀释至刻度，摇匀。将前者置参比池中，后者置样品池中，在247nm波长处测定差示吸收值。由标准曲线求得维生素B1片浓度，计算维生素B1片含量（标示量%）。
五、注意事项
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1.缓冲液（pH7.0）配制：取磷酸二氢钾0.68g，加氢氧化钠（0.1mol/L）29.1ml,用水稀
释至100ml,即得。
2.盐酸液（pH2.0）配制：取盐酸9ml,加水稀释成100ml。取10ml加水稀释成1000ml,即得。
3.所给测定波长仅供参考，可照“测定波长的选择”项下自行测定。
4.本实验线性范围为10ug/ml-30ug/ml,其回归方程：ΔA=0.002+0.0213c; r=0.9996
六、思考题
1.试述差示分光光度法如何消除干扰物的影响。
2.差示分光光度法用于制剂分析或原料药测定，主要有哪几种类型？ 3.差示分光光度法与直接紫外法比较，在准确性、方法选择性上有何不同？ 4.什么样的药物方可用不同pH条件下的差示分光光度法测定其含量？
实验四 兔血浆中氨茶碱的双波长分光光度法
一、目的要求
1. 掌握双波长分光光度法测定血浆中茶碱含量的基本原理 2. 熟悉双波长分光光度法测定血浆中茶碱含量的基本操作 3. 了解血样收集方法及血清样品的一般处理方法
二、基本原理
茶碱用于治疗支气管哮喘及其他呼吸不正常的疾病。茶碱的治疗血药浓度较窄(5～20μg/ml)，血浓高于25μg/ml时常出现中毒症状。而且服用同剂量茶碱的病人之间的治疗效果有明显差异，且与血药浓度有关，因此需进行临床用药监护。
茶碱不易溶于水，对胃肠道有刺激作用，故临床上常用其盐类制剂。氨茶碱系茶碱和二乙胺缩合而成，其溶解度为茶碱的20倍，在体液中分离出茶碱起效。在酸性条件下，可用有机溶剂从血浆中提出茶碱，并同时沉淀血浆蛋白；再用碱溶液把茶碱从有机溶剂中提出。在λ
274
和λ
298
测定碱性吸收液的吸收度(A)。A274为茶碱和本底(溶剂、血清)吸收度，A298
为本底的吸收度，茶碱的吸收度为?A=A274-A298。即可测定氨茶碱的血药浓度。
三、试验材料
1. 仪器 紫外分光光度计 低速离心机 2. 动物 家兔 3. 试剂
(1) 氨茶碱标准液(32mg/ml)：称取氨茶碱标准品适量，用水稀释成每1ml含32mg氨茶碱的
溶液。
(2) 氨茶碱标准溶液的配制：量取氨茶碱标准储备液适量，用0.1mol/LNaOH溶液稀释制成
每1ml分别含有0.5μg，1μg，2.0μg，4.0μg，8.0μg的溶液。 (3) 5%异丙醇氯仿溶液配制：量取乙丙醇25ml加到475ml氯仿中。
四、试验方法
1. 血浆样品制备
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取体重约为2.5kg的健康家兔，从颈静脉(或其他部位)取血约1.5ml，置于抗凝试管中，离心(3500r/min)10min，取空白血清。然后从耳静脉快速注射氨茶碱水溶液(32mg/ml)1.0 ml，分别于给药后0h、0.17h (10min)、0.33h (20min)、0.5h、1h、2h、3h从颈静脉(或其他部位)取血约1.5ml，离心。分取血浆样品至冰箱保存后待用。 2. 氨茶碱标准曲线的制备
分别取各浓度氨茶碱标准溶液4ml，以0.1mol/LNaOH溶液为空白，于274nm和298nm波长处测定吸收度，绘制?A～C标准曲线。 3. 血药浓度测定
吸取血浆样品0.5ml，置试管中，加0.1mol/LHCl溶液0.2ml，5％异丙醇氯仿溶液5ml，振摇混合，离心(3500r/min)10min,吸取氯仿层(下层)4.0ml置另一试管中，加入0.1mol/LNaOH溶液4.0ml，振摇均匀，离心(3500r/min)10min，吸取碱液(上层)3～3.5ml。空白同上，于274nm和298nm波长处测定吸收度。计算?A，根据工作曲线计算出茶碱在供试血浆样品中的量。
五、注意事项
1. 采出的血要在试管中转动，使血液充分与抗凝剂结合，防止血液在试管中凝结。 2. 在紫外分光光度法测定血浆样品中，首先用氯仿萃取茶碱。提取时振摇应缓慢进行(如常
采用上下轻轻颠倒的方式)，切勿强烈振摇，否则出现严重的乳化现象，使分层困难。分取氯仿层时，应先用滴管吸掉上层液，弃之；然后吸取下层氯仿层。
3. 提取分析时，氯仿的乳化会造成分离测定上的麻烦，用玻璃棒摩擦试管以破乳，或加几
滴乙醇破乳，最后离心使分层。
4. 因不同仪器的波长精密度略有差异，故在不同仪器上测定时应对波长组合进行校正。
六、思考题
1. 双波长分光光度法的原理是什么？ 2. 测定氨茶碱的双波是如何确定的？ 3. 血样的处理基本程序？
实验五 设计性实验
现有七种不同编号的药品，皆碾为粉末状，没有名称标签及标示量，可能为原料药或片剂或其他剂型，要求学生以4人一组，按下列实验内容或自选实验内容自行拟定实验题目，请根据其分子结构及理化特性，通过文献检索，设计实验方案，交指导老师审核后进行实验，并写出设计方案及实验报告。 一、目的要求
1、 掌握典型药物的特殊鉴别试验。
2、 掌握根据药物结构特征，区别各类药物，并根据各个药物的专属性试验进行鉴别确证。 3、 熟悉药物的其他鉴别试验。 二、主要药品
异烟肼、阿司匹林、维生素B1、对乙酰氨基酚、苯巴比妥、炔雌醇、硫酸奎宁。
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异烟肼 阿司匹林
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对乙酰氨基酚 苯巴比妥
炔雌醇
维生素B1
硫酸奎宁
三、实验方法
1、自行设计区别上述药物的方法，写出实验操作方法、理论依据和反应原理。
2、根据上述七类药物的结构、理化特性与鉴别方法的关系，结合自己的实验设计进行讨 论，然后根据实验室条件和实验时数，选择合适的区别与鉴别实验内容。 3、进行实际操作。对上述没有标签药物进行区别、确证。 四、注意事项
1、本次实验中的药品有不同剂型，必须要考虑辅料的影响。白色不溶性辅料对于沉淀反应及银镜等反应有干扰，应考虑在内。另外，由于辅料的存在，取样量也应适当增加。
2、应自行设计实验，文献中的方法虽然成熟可靠，但本次实验要求的是将这七种药品区分出来，针对的仅是这七种药品，并非对其进行严格完整的制剂鉴别，故只需考虑这七种药品结构上的不同及理化性质的差异，将其区分出来即可。
3、方法应当简单，快速。方法中试剂仪器尽可能常用、步骤尽可能简单，花费时间尽可能少。
4、设计实验前需充分了解各类药物的结构与理化特性，个性与共性，即一般鉴别试验与特殊鉴别试验。选择最具某类药物结构特征的鉴别试验来区别不同类型的药物；选择各个药物最具特征的专属反应来确证该药物。
试验六 冰片的含量测定
一、试验目的
1. 掌握气相色谱法测定的原理和方法 2. 掌握冰片含量测定的操作条件及要点
二、试验方法
冰片(合成龙脑)
(Borneolum Syntheticum; C10H18O; MW=154.25)
1.性状
本品为无色透明或白色半透明的片状松脆结晶；气清香，味辛、凉；具挥发性，点燃发生浓烟，并有带光的火焰。
本品在乙醇、三氯甲烷或乙醚中易溶，在水中几乎不溶。
3CCH3CH3OH2. 鉴别
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(1) 取本品10mg，加乙醇数滴使溶解，加新制的1%香草醛硫酸溶液1～2滴，即显紫色。
(2) 取本品3g，加硝酸10ml，即产生红棕色气体，待气体产生停止后，加水20ml，振摇，滤过，滤渣用水洗净后，有樟脑臭。
3.含量测定 照气相色谱法(中国药典2005版Ⅵ E)测定。
色谱条件与系统适应性试验 以聚乙二醇(PEG)-20M为固定相，涂布浓度为10%；柱温为140oC。理论塔板数按龙脑峰算应不低于1900。
校正因子测定 取水杨酸甲酯适量，精密称定，加乙酸乙酯制成每1ml含5mg的溶液，作为内标溶液。另取龙脑对照品50mg，精密称定，置10ml量瓶中，加内标溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，吸取1μl，注入气相色谱仪，计算校正因子。
测定法 取本品约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，用内标溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，吸取1μl，注入气相色谱仪，测定，计算，即得。
三、讨论
1.气相色谱测定龙脑含量时为什么使用内标法？ 2.试述气相色谱法的特点及分析适用范围。 实验条件：
进样口温度：230 柱温：120检测器： 260分流比： 79流速： 1.1吹扫气体： 3
实验七 复方磺胺甲噁唑片的质量分析
一、
试验目的
1． 熟悉复方制剂分析的特点
2． 掌握复方制剂和高效液相色谱法含量测定的原理 3． 掌握复方磺胺甲噁唑片试验操作条件与要点。
二、 试验原理
复方磺胺甲噁唑片
(Compound Sulfamethoxazole Tablets)
复方磺胺甲噁唑片为常用的磺胺类药物的复方制剂，每片中应含磺胺甲噁唑(C10H11N3O3S)应为0.360~0.440g，含甲氧苄啶(C14H18N4O3)应为72.0~88.0mg。 处方 磺胺甲噁唑 400g 甲氧苄啶 80g 制 成 1000片
三、 试验材料
磺胺甲噁唑 甲氧苄啶 复方磺胺甲噁唑片 紫外分光光度计 稀硫酸 稀盐酸 碘试液 亚硝酸钠溶液(0.1mol/L) 碱性β-萘酚试液 盐酸-氯化钾溶液 氢氧化钠试液 冰醋酸
四、 试验内容 1. 鉴别
(1) 取本品的细粉适量(约相当于甲氧苄啶50mg)，加稀硫酸10ml，微热溶解后，放冷，滤
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过，滤液加碘试液0.5ml，即生成棕褐色沉淀。
(2) 取本品的细粉适量(约相当于磺胺甲噁唑50mg)，显芳香第一胺的鉴别反应(中国药典
2005年版二部附录Ⅲ)。
2. 含量测定
照高效液相色谱法(附录Ⅴ D)测定。
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水-乙腈-三乙胺(799:200:1) (用氢氧化钠试液或冰醋酸调节pH值至5.9)为流动相；检测波长为240nm。理论塔板数按甲氧苄啶计算不低于4000，磺胺甲噁唑峰与甲氧苄啶峰的分离度应符合要求。 测定法 取本品10片，精密称定，研细，精密称量适量(约相当于磺胺甲噁唑44mg)，置100ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液适量，超声处理使主成分溶解，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取磺胺甲噁唑对照品和甲氧苄啶对照品各适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含磺胺甲噁唑0.44mg与甲氧苄啶89μg的溶液，摇匀，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。
五、 注意事项
芳香第一胺的鉴别反应(中国药典2005年版二部附录Ⅲ) 取供试品约50mg，加稀盐酸1ml，必要时缓缓煮沸使溶解，放冷，加0.1mol/L亚硝酸钠溶液数滴，滴加碱性β-萘酚试液数滴，视供试品不同，生成由橙黄到猩红色沉淀。
六、 思考题
1. 在HPLC法测定复方磺胺甲噁唑含量时，应注意哪些基本试验条件及操作注意点？ 2. 2000年版中国药典采用双波长分光光度法测定复方磺胺甲噁唑含量，请说明双波长
法测定的原理并比较两种测定方法的特点。
分别说明本品中鉴别试验的原理。
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