兽用化学药物非临床药代动力学试验指导原则

一、概述

（一）定义与目的

非临床药代动力学研究是指通过实验动物（有时还有靶动物）体内、外及靶动物体外的试验，获取基本的药代动力学参数，从而阐明药物吸收、分布、代谢、排泄过程与特点。

药物在体内的动态过程受药物的理化性质、剂型等影响。理化性质包括解离常数、脂溶性、溶解性、粒度、晶型和稳定性（如在胃肠道）等。剂型因素包括制剂、制备工艺、给药途径等。

非临床药代动力学是药物非临床有效性和安全性研究的重要内容，在新药研究开发中占有重要地位。药物或其代谢物的体内、外浓度及其药代动力学参数，能帮助确定剂量、定量阐明药物的作用（药效或毒性）及机理、认识药物相互作用的规律，是药理学研究的主要内容之一；能帮助选择剂型、评价制剂的特点和质量，是药剂学的基本数据；能为临床研究方案的设计与优化提供必要信息，是临床有效性和安全性研究的前提与基础；能揭示药物代谢及动力学参数的种属差异，是兽药残留及动物源食品安全性研究的重要内容。

（二）适用范围

本指导原则适用于非临床药代动力学各项研究内容的试验设计和要求。研究者应根据临床需要，结合药物和制剂的特点，参考本指导原则制订出合理、可行的研究方案，并对试验结果进行综合评价。

二、分析方法

（一）分析方法选择

合适、可靠的分析方法是药代动力学研究的关键。全血、血浆、血清、尿、粪、各种组织等样品的取样量少，药物浓度低，内源性物质（如无机盐、脂质、蛋白质、代谢物以及其他药物）干扰大，个体差异明显，影响样品中活性成分含

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量的测定。因此，必须根据被测物的结构、性质、浓度范围和样品介质等具体情况，建立相应的分析方法。

生物样品中药物测定法有色谱法，如高效液相色谱法（HPLC），气相色谱法（GC）；色谱-质谱联用法，如液相色谱-质谱联用法（LC-MS），液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），气相色谱-质谱联用法（GC-MS），气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）；放射性同位素标记法，免疫学法，如酶免疫分析法，荧光免疫分析法，放射免疫分析法；微生物学法。应根据被测物的性质选择特异、灵敏、可靠的方法。

在需要同时测定多种化合物的情况下，应首选色谱法。色谱法将分离和定量同步进行，特异性好，检测器的灵敏度也能满足要求。在需要同时测定原形和代谢物以解决药物的质量平衡或体内转归问题时，放射性同位素标记法灵敏度最好，配色谱法具有良好的特异性。色-质联用法在特异性、灵敏度和分析速度上有优势。

抗生素可用微生物学法。蛋白质或多肽类物质可用免疫学法。

为保证方法的可靠性，还须对方法的性能做确证，以考察从样品采集到分析测试的全过程中环境、介质、材料和操作对测定的影响。确证分全面确证和部分确证两种。首次建立的分析方法应做全面确证，其他方法视情况可做部分确证。

（二）分析方法建立及确证指标

1.特异性 指在干扰物存在情况下，分析方法专一、准确测定被测物的能力。建立分析方法前，应明确被测物是药物的原形还是其活性代谢物，是一个还是多个成分。内源性物质、其他代谢物或降解产物、环境因素等不得干扰测定。为证明分析方法的特异性，色谱法应提供6个不同来源的空白样品的色谱图、空白样品添加对照物的色谱图（应注明浓度）和用药样品的色谱图，质谱法则应考察介质效应如离子抑制。

2.标准曲线 反映被测物浓度与仪器响应值之间的定量关系，一般用回归分析（如加权最小二乘法）所得的回归方程和相关系数表示。标准曲线由低浓度到高浓度的范围为定量范围，定量范围内浓度的准确度和精密度应符合“4.准确度”和“5.精密度”的要求。

配制标准溶液应使用与待测样品相同的生物介质。不同的样品应制备各自的

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标准曲线。标准曲线的浓度个数取决于被测物可能的浓度范围和被测物/响应值关系的性质。一般至少用5个浓度，非线性的要增加浓度。标准曲线的定量范围应能覆盖全部待测样品的浓度范围。建立标准曲线时，应随测空白基质，但计算时不包括该点，仅用于评价干扰。

标准曲线各浓度的实测值与标示值之间的偏差在可接受的范围内时，判定标准曲线合格。可接受范围一般规定为最低浓度的偏差在±20%以内，其余浓度的偏差在±15%以内。只有合格的标准曲线才能用于定量计算。标准曲线不包括零点，不得用定量范围外推法求算样品中被测物的浓度。线性范围较宽时，为使低浓度得到准确计算，建议采用加权法计算偏差：偏差=[（实测值－标示值）/标示值]×100%。

微生物学和免疫学分析法的标准曲线，本质上是非线性的，应采用比化学分析法更多的浓度点建立标准曲线。

3.检测限和定量限 建立分析方法时，应测定背景信号（噪音）的标准偏差，确定方法的检测限（limit of Detection，LOD）和定量限（limit of Quantitation，LOQ）。LOD为噪音均值加3倍标准差，LOQ为噪音均值加10倍标准差。LOQ一般是标准曲线的最低浓度，应满足被测物在3～5个消除半衰期时刻或峰浓度（Cmax）1/20~1/10时刻浓度的测定。LOQ的准确度和精密度应符合“4.准确度”和“5.精密度”的相关要求，要由至少5个标样浓度的测试结果予以证明。

4.准确度 反映在确定的分析条件下，样品中被测物的测得浓度与真实浓度的接近程度（即质控样品的实测浓度与真实浓度的偏差）。重复测定已知浓度被测物的样品可获得准确度。在实际工作中，准确度通常用回收率（recovery）表示。用样品中被测物的响应值除以标准品的响应值，即为被测物的提取回收率。一般在空白样品中添加3个已知浓度测定回收率。一个浓度为LOQ加2倍标准差，一个为标准曲线的中间浓度，另一个为标准曲线的定量上限减2倍标准差。每个浓度平行测6次，回收率一般应在85％～115％范围内。LOQ附近浓度的回收率可在80％～120％范围内。

5.精密度 反映在确定的分析条件下，相同介质中相同浓度一系列测量值的分散程度。通常用质控样品的批内和批间相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）或变异系数（coefficient of variation, CV）表示。精密度的测定方法与回收

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率相同。6次重复测定的CV，浓度高于0.1μg/mL的为10％，低于0.1μg/mL的为20％。为获得批间精密度，应至少在不同天连续制备并测定3个分析批的样品。批间CV，一般应小于15％。LOQ附近浓度的CV，可小于20％。

微生物学和免疫学法的准确性和精密性，应采用6个分析批、每批4个浓度（LOQ、低、中、高浓度）的质控双份样品予以测定。

6.被测物的稳定性 在样品分析周期内的不同时间，应考察3个添加浓度样品、2个添加浓度各3次冻融样品、用药动物样品以及储备液和样品提取液等介质中被测物在不同温度（如室温、冷藏、冰冻）和不同贮存时间下的稳定性。

7.分析系统的稳定性 为确保分析系统在整个分析过程中是稳定的，要测定标准曲线的重现性，应至少在每次分析开始和结束时用标准品进样测定。

（三）质量控制

分析方法只有经过严格考核之后才能用于待测样品的检测。考核一般由独立的分析人员配制不同浓度的质控样品进行。质控样品是将已知量被测物添加到空白样品中配制而成。

来自同一个体的生物样品最好在同一批内测定。每批样品测定时，应建立新的标准曲线，并同时测定高、中、低三个浓度的质控样品。每个浓度至少为双份，应均匀分布在待测样品的分析顺序中。当一个分析批中待测样品的数量较多时，应增加各浓度质控样品的数量，使质控样品数大于待测样品总数的5%。质控样品测定结果的偏差一般应小于15%，低浓度的偏差可在20%以内。最多允许1/3质控样品（不同浓度）的偏差超限。如果质控样品的测定结果不符合上述要求，则该分析批的测定结果作废。

每个待测样品一般只做单次测定，必要时（如重现性和/或准确性差时）可重复测定。影响微生物学法和免疫学法可靠性的关键因素是准确性，如果重复测定能改善方法的准确性，则应在方法确证和待测样品分析中做重复测定。复测的标准应在试验之前确定，并记载于方法的标准操作规程（standard operating procedures，SOP）之中。

浓度高于定量上限的样品，应使用空白样品的提取液稀释后重新测定。对于浓度低于定量下限的样品，在峰浓度（Cmax）前采样的，以零值计；在Cmax后采样的，以无法定量（not detectable，ND）处理，以减小零值对AUC计算的影响。

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整个分析过程应遵从预先制订的SOP和GLP原则。

三、试验设计

（一）药-时曲线和药动学参数研究

1.受试物

应提供受试物的名称、剂型、批号、来源、纯度、保存条件、配制方法及研制单位的质检报告。剂型应与药效学研究所用的相一致。

2.实验动物

动物品种有小鼠、大鼠、兔、豚鼠、犬等。

选择原则：一般用成年、健康、清醒（不麻醉）的动物。首选动物要尽可能与药效学及毒理学的研究一致，创新药应使用两种或两种以上动物（一种为啮齿类，另一种为非啮齿类），其他类药可只用一种动物。同一动物应能多次采样。

以药-时曲线每个时间点不少于5只动物的数据为限计算所需动物数。应尽量从同一动物多次取样，避免用多只动物合并的数据。采用多只动物合并数据的，应增加动物数，以减少个体差异的影响。受试动物宜雌雄各半。如发现药动学存在明显的性别差异，应增加动物数。对于单一性别用药物，可选择与临床用药一致的性别做试验。

3.给药

给药途径、方式和次数，应尽可能与临床用药一致。口服给药的，动物一般在给药前禁食12小时以上。给药后的禁食时间，应根据具体情况统一规定，以避免数据波动和食物的影响。

试验剂量至少用2～3个，以便考察药物的体内过程会否出现非线性。高剂量最好接近最大耐受剂量，中、小剂量取有效剂量的上、下限。

对于消除半衰期长（如给药间隔短于4个t1/2）、有蓄积倾向且临床需重复给药的药物，应进行多次给药的药代动力学研究。多次给药的药动学一般用一种剂量（有效剂量）试验。根据药效学和单次给药的药代动力学结果，确定给药剂量、间隔和疗程。

4.采样

采样点的安排对完整药-时曲线和药动学参数获得影响很大。采样点应覆盖

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药物的吸收相、平衡相和消除相。吸收相不少于3个点，血药峰浓度（Cmax）附近至少要3个点，消除相4~6个点。对于血管外给药吸收快的药物，应避免第一点是峰浓度。采样时间至少应持续到3～5个消除半衰期（t1/2）或Cmax的1/20~1/10。给药前采空白样品。试前应通过预试确定合理的采样点。

5.数据处理与分析

要选用合适的数据处理及统计学方法。计算机程序要注明名称、版本和来源。 应由每个动物的血药浓度-时间数据分别计算药代动力学参数。静脉注射给药，要求计算t1/2、表观分布容积（Vd）、血药浓度-时间曲线下面积（AUC）和清除率（CL）等。可同时用统计矩法计算平均滞留时间（MRT）和药时曲线下面积（AUC0-t，AUC0-∞）。血管外给药，除上述参数外，尚须得出Cmax、达峰时间（tmax）和吸收速率常数（Ka）等，以反映药物吸收的规律。

（二）吸收与生物利用度研究

对于经口给药的创新药，应使用整体动物并同时开展血管内给药试验，确定绝对生物利用度。如有必要，可做在体或离体肠道吸收试验，揭示药物吸收的特性及影响因素。

对于血管外给药和其他改变剂型的药物，应尽可能提供绝对生物利用度。

（三）分布及血浆蛋白结合研究

1.分布研究

一般用大鼠或小鼠，做一个剂量（有效剂量）。给药后，一般测定药物在心、肝、脾、肺、肾、胃肠、生殖腺、脑、体脂、骨骼肌等组织的浓度，以了解药物在体内的主要分布组织。要特别注意药物浓度高、蓄积时间长的组织和器官，以及药效或毒性靶器官中药物的分布情况。若药物对造血系统有影响，应考察其在骨髓的分布。参考血药浓度-时间曲线，选取3个时间点分别代表分布相（或吸收相）、平衡相和消除相，以定量考察药物在各个时刻每个组织中的分布。药物浓度较高的组织应增加观测点，以进一步研究消除情况。每个时间点，至少应有5个动物的数据。做分布实验，必须注意取样的代表性，如取1/2或1/4个肾应对称。

以下情况应考虑做重复给药的组织分布研究：药物或代谢物在组织中的消除半衰期明显大于其血浆消除半衰期，并且是毒性研究给药间隔的两倍；重复给药

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的药代动力学或毒代动力学发现，血中药物或代谢物的稳态浓度显著高于单次给药药代动力学预期的浓度；在短期毒性、单次给药的组织分布和药效学等研究中观察到未预料的、有重要意义的组织病理学改变；定位靶向释放药物。

采用放射性同位素标记法做组织分布试验的，应说明标记物的放化纯度、标记率（比活性）、标记位置、给药剂量等；放射性分析方法，如分析仪器、本底计数、计数效率、校正因子、样品制备过程等；放射性示踪生物学试验的详细过程，生物样品测定时对放射性衰变进行校正的方程。要尽可能提供给药后不同时相的整体放射自显影图像。

2.血浆蛋白结合研究

一般情况下，只有游离的药物才能通过生物膜向组织扩散、被肾小管滤过或肝脏代谢。药物与血浆蛋白结合会影响药物的分布及消除动力学过程，降低药物在靶位的浓度和作用强度。药物的血浆蛋白结合率试验方法，有平衡透析法、超过滤法、分配平衡法、凝胶过滤法和光谱法等。要根据药物的理化性质和实验室条件，选择一种方法做至少3个浓度（包括有效浓度）的血浆蛋白结合率试验，每个浓度至少重复试验3次。要说明血浆蛋白结合率是否存在浓度依赖性。

对于血浆蛋白结合率高于90%的药物，建议开展体外药物竞争结合试验，以考察临床上有可能合用的高蛋白结合率的药物在蛋白结合上的相互作用。

为预测和解释实验动物、靶动物在药效学及毒性反应方面的差异性和相关性，建议同时开展实验动物和靶动物的血浆蛋白结合率比较试验。

（四）代谢与排泄研究

1.代谢研究

创新药要确定主要代谢途径和主要代谢物的结构及活性性质，创新的前药还应系统地开展原药和活性代谢物的药代动力学研究。

对于主要以代谢消除的新药（原形的排泄量<50%），代谢研究可分成两个阶段进行：临床前阶段采用色谱、放射性同位素标记或色-质联用等方法，分离、分析和确证主要的代谢物；临床阶段，对临床II期证明具有进一步研究开发前景的药物，应尽早对活性较强的代谢物展开研究，包括代谢物的动力学参数、代谢途径等。

创新药应观察药物对实验动物和靶动物微粒体细胞色素P450的诱导或抑制

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作用，以了解药物在代谢上的潜在相互作用。酶的抑制作用可用底物法测定，诱导作用可在整体动物多次给药后观察肝P450活性的变化。

实验动物和靶动物肝的组织匀浆、细胞悬液、微粒体及灌流器官等，可方便、经济地用来研究药物的代谢途径、动力学特点、代谢酶对动力学参数影响、药物或代谢物与蛋白质或DNA结合等，是体内药代动力学研究的补充，对深入阐明药物的药效和毒性机理有重要价值。

2.排泄研究

（1）经尿和粪排泄 一般用小鼠或大鼠。将动物置代谢笼内，用一个有效剂量给药后，按事先设计的时间间隔分段收集全部尿液和粪样，直至药物排尽为止。给药前应采取空白尿液和粪样。试验前应做预试，使设计的采样时间点能覆盖药物及其主要代谢物从尿粪中排泄的起始、达峰和基本结束等全过程。

尿样要记录体积，混匀，量取一部分测定药物及其代谢物浓度。粪样凉干后称重。注意：不同动物的粪便，干湿不同。用合适的溶剂，按一定比例将粪样制成匀浆，记录总体积，量取一部分测定药物及其代谢物的浓度。最后，计算药物和代谢物经粪和尿排泄的量和速率。每个时间点应至少有5只动物的数据。

（2）经胆汁排泄 一般用大鼠在乙醚麻醉下做胆管插管引流，待动物清醒后，经多种途径给药，并以合适的时间间隔分段收集胆汁，测定药物及其主要代谢物的含量，计算排泄的量和速率。

四、试验报告

研究报告应注明试验的单位、负责人、日期、人员（并签名盖章）、项目编号。正文前应有简短摘要，缩略语列表，文后附参考文献，标准操作规程列表。正文包括以下内容：

1.目的意义

项目的重要性、必要性及立项依据。 2.分析方法

分析方法类型、编号，仪器设备、分析条件，确证简化的理由，方法学详细描述，对照品（被测药物、代谢物、内标物）的纯度和来源，稳定性实验描述及相关数据，选择性、准确度、精密度、回收率、定量限、标准曲线的实验数据，代表性图谱。用于计算结果的回归方程，样品测定时标准曲线列表，各分析批

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QC样品测定结果及其精密度、准确度综合列表，任何可能偏离分析方法建立条件的情况。

样品编号、采集日期，运输前保存及运输情况，分析前保存情况。分析批的编号、分析日期、分析方法、分析人员、始止时间、主要设备和材料，标准曲线和QC样品图谱复印件，各分析批待测样品浓度计算结果，20%样品测定图谱的复印件。

缺失样品的原因，重复测试的结果。应对舍弃的任何数据、报告选择的数据说明理由。

3.试验设计

受试品来源，参比品及选用理由。受试动物背景资料，动物数及分组设计，给药剂量及方法，采样时间安排。试验期间动物的日粮性质，喂饮方式与频率，禁食等。给药后动物的临床不良反应，受试动物中途退出、脱落的记录及原因说明。从文献提供药物的红细胞摄取和蛋白结合的特点，包括蛋白结合的程度和结合蛋白的类型。

4.数据与参数

以药时曲线和药动学参数研究为例，其他参考执行。数据处理与统计学方法。单次给药，提供每个动物及全部动物汇总的血药浓度-时间数据、曲线图、主要参数，临床前药代动力学规律和特点的讨论与评价。多次给药，提供每个动物及全部动物汇总的首次给药后的血药浓度-时间数据、曲线图、药代动力学参数，至少3次给药的谷浓度、平均稳态浓度、波动系数，末次给药后的稳态血药浓度-时间数据、曲线图，比较首次与末次给药的药-时曲线的动力学参数。

5.总结与评价

对所获取的数据要做科学、全面的分析，阐明药物吸收、分布和消除的特点，经尿、粪和胆汁排泄的情况，与血浆蛋白结合的程度，体内蓄积的程度和主要蓄积的器官或组织。创新药还应阐明在体内代谢、消除的过程和质量平衡规律。

要对结果做综合评价，把药物的药代动力学特点与其制剂、有效性和安全性等有机联系起来，找出相关性，为药物的整体评价和以后的临床研究提供更有价值的资料。

对于改变酸根、晶型的药物，要根据药物的特点及改变的具体情况确定是否

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做改变前后的药代动力学比较研究。

对映异构体的物理性质（旋光性除外）和化学性质（在手性环境中除外）相同，但可能具有不同的药代动力学性质和药理、毒理特点（质的，量的）。研究者应建立适用于对映体选择性分析的定量方法，研究对映体之间相互转化的可能性和每种对应体吸收、分布、代谢和排泄的规律。如果是外消旋体且两对映体的药代动力学性质不同，研究者应分别研究各对映体的剂量线性关系、代谢/排泄性质和药物相互作用的影响。若两对映体的药代动力学曲线相同或它们的血浆浓度保持恒定比值，则非手性分析或只对其中一个对映体做研究即可。如果是开发单一对映体，则应研究说明该对映体转化为另一对映体的程度、该对映体的药动学性质与其作为外消旋体组分时的药代动力学性质是否一致。应将单一对映体在实验动物体内的药-时曲线与其在靶动物体内的药时曲线进行比较，以确定对映异构体在不同动物体内的相互转化和处置的特点。

对于新的复方制剂，应比较复方和单方的药代动力学特点，考察药物间的相互影响，阐明组方的合理性。

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